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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 |
AS6321256 | 纖維素含量(CLL)測(cè)試盒(比色法) | 100管/96樣 |
AS6321256 | 纖維素含量(CLL)測(cè)試盒(比色法) | 50管/48樣 |
測(cè)定意義:
纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起,是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維,是自然界中分布含量最多的一種多糖。
測(cè)定原理:
纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖,在酸性條件下加熱能分解成β-葡萄糖。β-葡萄糖在強(qiáng)酸作用下,可脫水生成β-糠醛類(lèi)化合物。β-糠醛類(lèi)化合物與蒽酮脫水縮合,生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測(cè)定纖維素含量。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、80%乙醇、丙酮、濃硫酸(不允許快遞)、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL× 1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體10mL× 1支,4℃保存。
樣品的前處理:
細(xì)胞壁的提?。喝〖s0.3g樣本,加入1mL 80%乙醇,室溫快速勻漿,90℃水浴20min(加熱過(guò)程中EP管可能爆開(kāi),建議用膠帶封口或使用防爆EP管),冷卻至室溫,6000g 25℃離心10min,棄上清。沉淀加入1.5mL80%乙醇和丙酮各洗一遍(渦旋振蕩2min左右,6000g 25℃離心10min,棄上清即可),沉淀即為粗細(xì)胞壁,加入1mL試劑一(去除淀粉)浸泡15小時(shí),6000g 25℃離心10min,棄上清,將沉淀干燥,稱(chēng)重得細(xì)胞壁物質(zhì)(CWM)。
纖維素的提取:稱(chēng)取烘干的CWM 約5mg,加入0.5mL蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬,可先研碎后再加入0.5mL蒸餾水勻漿,或者用勻漿器勻漿),勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中,用蒸餾水定容至0.5mL,置于冰水浴中,緩慢加入0.75mL濃硫酸,混勻,冰水浴中靜置30min。8000g 4℃離心10min,取上清液,用蒸餾水稀釋20倍后待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至620nm,蒸餾水調(diào)零。
2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。
3、工作液的配制:在試劑二中加入4mL試劑三,充分溶解,如較難溶解,可加熱攪拌;用不完的試劑4℃保存一周;
4、加樣表(在EP管中反應(yīng)):
試劑(μL) | 空白管 | 測(cè)定管 |
樣本 | 150 | |
蒸餾水 | 150 | |
工作液 | 35 | 35 |
濃硫酸 | 315 | 315 |
混勻,置95度水浴中10min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻至室溫后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,于620nm處,分別讀取空白管和測(cè)定管吸光值,ΔA=A測(cè)定管-A空白管。
注意:
1、空白管只要做一管。
2、由于濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性,請(qǐng)謹(jǐn)慎操作。
纖維素含量計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 7.875x - 0.0043;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:
纖維素(mg /g干重)= [(ΔA+0.0043) ÷7.875×V1]÷(W×V1÷V2)×20=3.17×(ΔA+0.0043) ÷W。
V1:加入樣本體積,0.15mL;V2:加入提取液體積,1.25mL;W:樣本干重,5×10-3g;20:樣本稀釋倍數(shù)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 5.25x - 0.0043;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:
纖維素(mg /g干重)= [(ΔA+0.0043) ÷5.25×V1]÷(W×V1÷V2)×20=4.76×(ΔA+0.0043)
÷W。
V1:加入樣本體積,0.15mL;V2:加入提取液體積,1.25mL;W:樣本干重,約5×10-3g;20:樣本稀釋倍數(shù)。
注意:檢測(cè)限為1mg/g干重或10ng/ mg prot
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