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貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321224 | 蔗糖磷酸化酶(SP)測試盒(比色法) | 100管/96樣 |
AS6321224 | 蔗糖磷酸化酶(SP)測試盒(比色法) | 50管/48樣 |
測定意義:
SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷鍵,催化葡萄糖基轉移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相應的葡萄糖基低聚糖。此外,SP還能催化合成熊果苷,具有的美白效果,在化妝品工業(yè)中具有重要應用。
測定原理:
SP能夠以磷酸為受體,催化蔗糖產生1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖,在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH,導致340nm光吸收值增加。測定340nm吸光度增加速率,即可計算SP活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋、酶標儀、96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1支,-20℃避光保存,臨用前加2.5mL蒸餾水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑三:粉劑×1支,-20℃避光保存,臨用前加5mL蒸餾水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
粗酶液提?。?/p>
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心10min,取上清待測。
細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作表:
1.酶標儀預熱30min,調節(jié)波長至340nm。
2.操作表
試劑名稱 | 對照管 | 測定管 |
試劑一(μL) | 120 | 120 |
試劑二(μL) | 20 | 20 |
試劑三(μL) | 40 | 40 |
樣本(μL) | 20 | |
蒸餾水(μL) | 20 | |
迅速混勻,于96孔板,37℃下測定340nm的初始吸光值與反應2min后的吸光值,測定管記作A1與A2,對照管記作A3與A4,△A=(A2- A1)-(A4- A3)。 |
SP活性計算公式:
1. 按照蛋白濃度計算
酶活定義:37℃,pH6.8時,每毫克蛋白質每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性(nmol/min/mg prot)=×V反總÷V樣÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr
按照樣本質量計算
酶活定義:37℃,pH6.8時,每克樣本每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性(nmol/min/g 鮮重)=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1608×△A÷W
3. 按照細胞數(shù)量計算
酶活定義:37℃,pH6.8時,每104個細胞每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性(nmol/min/104 cell)=×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量(萬個))÷T=1608×△A÷細胞數(shù)量(萬個)
:NADPH摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應體系總體積,0.2mL;V樣:反應體系中樣本體積,0.02mL;W:樣本質量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,2min
注意事項:
可選用BCA法測定蛋白含量試劑盒測定蛋白含量。
樣本較多時,可以按照每個樣本試劑一:試劑二:試劑三=120:20:40(μL)的比例配制工作液,用多少配多少,臨用前立刻配制,10分鐘內使用。
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