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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321299 | 土壤亞硝酸還原酶(SNiR)測(cè)試盒 | 100管/48樣 |
AS6321299 | 土壤亞硝酸還原酶(SNiR)測(cè)試盒 | 50管/24樣 |
測(cè)定意義
土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一,參與亞硝酸鹽至NO的還原反應(yīng),它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉(zhuǎn)化效率,為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。
測(cè)定原理
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少,即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。
試劑的組成和配制
試劑一:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。
試劑三:液體4mL×1瓶,4℃保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑四:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑五:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
樣品處理
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干,過30~50目篩。
測(cè)定操作表
空白管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
風(fēng)干土樣(g) | 0.02 | 0.02 | |
蒸餾水(μL) | 40 | ||
試劑一(μL) | 40 | 40 | |
試劑二(μL) | 40 | 40 | 40 |
混勻后,25℃反應(yīng)1h | |||
試劑三(μL) | 40 | 40 | 40 |
充分震蕩30S,10000rpm,4℃,離心10min | |||
上清液(μL) | 70 | 70 | 70 |
工作液(μL) | 140 | 140 | 140 |
充分混勻,靜置3min后測(cè)定540nm處吸光值,分別記為A空白管、A對(duì)照管、A測(cè)定管。空白管只要做一管,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 |
計(jì)算公式
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.5562x+ 0.0088,R2 = 0.996;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。
酶活單位定義:每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)酶活力單位。
S-NiR(μmol /d /g土樣)=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷1.5562×V標(biāo)÷W÷T
= 0.617×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W
T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d;V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mL;W:樣本質(zhì)量,g。
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.7781x+ 0.0088,R2 = 0.996;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)。
酶活單位定義:每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)酶活力單位。
S-NiR(μmol /d /g土樣)=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷0.7781×V標(biāo)÷W÷T
= 1.234×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W
T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d;V標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mL; W:樣本質(zhì)量,g。
注意事項(xiàng)
配制好的工作液3天內(nèi)使用完。
若吸光值超過1.5,將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
嚴(yán)格控制顯色時(shí)間,否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)線性范圍為0.02-1.5。
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