反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
產(chǎn)品名稱 | 新生隱球菌PCR檢測試劑盒價(jià)格 |
英文名稱 | Cryptococcus neoformansPCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點(diǎn):
高特異性:與其他病毒無交叉反應(yīng),無非特異性擴(kuò)增;
高靈敏度:檢測靈敏度可達(dá)10~100;
操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)檢測;
高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
樣品 DNA 的制備:
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對(duì)照(以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
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使用及效果:
PCR反應(yīng)特點(diǎn)
(1) 特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對(duì)原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。
SRGN/serglycin抗體,兔多抗,抗原親和純化66575-29-9C22H34O7Forskolin≥98%ELISA WB 佛司可林
ELISAKitforHumanKallikrein-61g 0.312-20 ng/mL1,8-二羥基蒽醌 CHRYSAZIN(RG)
PS瓊脂1g 250gPMSF 苯基黃酰
人胎盤蛋白(GD)ELISA試劑盒1g 3.12-200 ng/mLDL-精氨酸 ARGININE, D/L-(RG)
ELISAKitforHumanAdenylatecyclasetype133457-62-4 20mgAlnustone HPLC≥98% 0.156-10 ng/mL榿木;榿木
ELISAKitforThyroxine50mg 1.56-100 nmol/L黃肉楠堿 ACTEIN(P)
小鼠骨骼肌細(xì)胞 20mg HPLC≥98%Kaempferide用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養(yǎng)瓶山素;3,5,7-三羥基-4’-氧基黃;山-4’-O-
TNFR2/CD120b/TNFRSF1B中和抗體25GB/N 溴百里藍(lán) Bromothymol Blue
人載脂蛋白A4(apo-A4)ELISA試劑盒134-01-0 20mgPeonidin chloride HPLC≥98% 15.6-1000 pg/mL氯化芍藥素
Transferrin/TF抗體,兔單抗2415-24-9HPLC≥98%A021520mg/支ELISA 梓
ELISAKitforHumanCelldivisioncontrolprotein42homolog225110-25-8 20mg Falcarindiol 3.12-200 ng/mL法卡林二
大鼠支氣管上皮細(xì)胞 20mg HPLC≥98%Hupehenine用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養(yǎng)瓶湖貝素;梭砂貝母堿;新貝母堿
人高遷移率族蛋白HMG-I/HMG-Y(HighmobilitygroupproteinHMG-I/HMG-Y)ELISA試劑盒139446-82-55mg 5-O-Methylvisammioside 0.156-10 ng/mL5-O-基維斯阿米-4'-O-β-D-呋芹糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷
肉湯培養(yǎng)基A1kg 250gPEG3350 聚乙二
CD200/OX-2抗體,兔多抗30045-16-0HPLC≥97.50%A078220mg/支ELISA WB 脫氫紫堇堿
麥康凱瓊脂培養(yǎng)基011-20171 250gWako 011-20171 大腸癌疾病造模試劑
新生隱球菌PCR檢測試劑盒價(jià)格東莨菪 85700-55-6 產(chǎn)毒培養(yǎng)基/Toxin-ProducingMedium
Cats Claw (Uncaria tomentosa) Inner Bark of Stem Extract #1 BXL(REQUEST QUOTE) 1mg ELISAKitforHumanNuclearreceptorcorepressor1
辛酸 CAPRYLIC ACID(AS) 100mg MOG抗體,兔單抗
(1-溴乙基)苯 (1-Bromoethyl)benzene >95.0%(GC) 25G 人鉀電壓閥門通道亞家族B成員2(KCNB2)ELISA試劑盒
原花青素B標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒 PROCYANIDIN B STANDARDS KIT(P) 2 x 5mg CD137/4-1BB抗體,兔多抗
4,4'-二氧基查耳 DIMETHOXYCHALCONE,4,4'-(RG) 100mg ELISAKitforHumanProteinLYRIC
硼酸三鄰苯酯 Tri-o-tolyl Borate >98.0%(T) 5ML ELISAKitforHumanProteinWnt-7a
常春藤標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒 IVY STANDARDS KIT(SH) 3 x 10mg ELISAKitforHuman14-3-3proteinsigma