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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321388 | 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)測試盒 | 100管/96樣 |
AS6321388 | 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)測試盒 | 50管/48樣 |
測定意義:
二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶,既控制著CO2的固定,同時(shí)又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。
測定原理:
在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO2結(jié)合,產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸,并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶I氧化速率,還原型輔酶I氧化速率可反應(yīng)Rubisco的活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:25mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入10mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入10mL試劑一,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入1 mL試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
(注意:試劑二、三、四溶解后,按需分裝-20℃保存。)
粗酶液制備:
①總Rubisco酶提?。?/strong>建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定。
②胞漿和葉綠體Rubisco酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4℃,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4℃,8000g離心10min,取上清用于測定胞漿Rubisco酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測定葉綠體中Rubisco酶活性。
建議測定總Rubisco酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco,則按照步驟②提取粗酶液。
(注意:粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。)測定步驟:
分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
樣本測定
工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三1:1混合,用多少配多少;
在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL樣本、10uL試劑四和180uL工作液,混勻,立即記錄340nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和5min20s時(shí)的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
Rubisco活性計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下:
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。
Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr
此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。
2、按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
上述計(jì)算公式中各符合含義:
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5min;W:樣本質(zhì)量,g。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下:
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。
Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr
此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。
2、按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:25℃中1 g組織1 min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
上述計(jì)算公式中各符合含義:
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;W:樣本質(zhì)量,g。
公司正在出售的產(chǎn)品:
T-TM ELISA Kit | Hepsin蛋白ELISA試劑盒 |
Ataxin 10(ATXN10)ELISA Kit | Na+/H+交換體3ELISA試劑盒 |
MAP磷suanmei雙特異性磷suanmei1ELISA試劑盒 | N-甲基-D-天氡氨suan離子能谷氨suan受體2DELISA試劑盒 |
Nicolin1蛋白ELISA試劑盒 | Recepin蛋白ELISA試劑盒 |
雞β內(nèi)酰胺mei(β-lactamase)ELISA檢測試劑盒 | 大鼠尿激mei(UK)ELISA試劑盒 |
抗髓磷脂抗體IgAELISA試劑盒 | 人唾液suanmeiELISA試劑盒 |
人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)試劑盒elisa | O-唾液suan糖蛋白內(nèi)肽meiELISA試劑盒 |
人旋毛蟲抗體(Trichinella Ab)ELISA檢測試劑盒 | 蔓荊子染料法PCR鑒定試劑盒 |
空腸彎曲桿菌PCR試劑盒 | 人線粒體DNA PCR檢測試劑盒 |
腺病毒B型PCR試劑盒 | 人免疫缺陷病毒II型A組前病毒PCR試劑盒 |
馬類圓線蟲PCR檢測試劑盒 | 坎氏弧菌PCR試劑盒 |
綠膿桿菌PCR檢測試劑盒 | MMP-4 大鼠基質(zhì)金屬蛋白4ELISA檢測試劑盒 |
Citron蛋白(CIT)ELISA試劑盒 | 空腸彎曲菌PCR檢測試劑盒 |
chemerinELISA試劑盒 | 人乳鐵蛋白(hLTF)轉(zhuǎn)基因成分核suan檢測試劑盒 |
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接分子1(STAM1)ELISA試劑盒 | CG 大鼠絨毛膜促性腺激suELISA檢測試劑盒 |