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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321376 | 丙酮酸羧化酶(PC)測(cè)試盒(比色法) | 100管/96樣 |
AS6321376 | 丙酮酸羧化酶(PC)測(cè)試盒(比色法) | 50管/48樣 |
測(cè)定意義:
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中,催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,是糖異生過程的第一個(gè)限速酶,在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。
測(cè)定原理:
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm下測(cè)定NADH氧化速率,即可反映PC活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體13uL×1支,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞,加入1mL提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
將勻漿600g,4℃離心5min。
棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PC(此步可選做)。
在步驟④的沉淀中加入1mL提取液,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體PC活性測(cè)定。
測(cè)定步驟:
分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四的配制:在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和 2min后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.5,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定,使ΔA小于0.5可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
PC活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
公司正在出售的產(chǎn)品:
APT ELISA Kit | G抗原1ELISA試劑盒 |
AST ELISA Kit | Muskelin1蛋白ELISA試劑盒 |
Limkainβ1蛋白ELISA試劑盒 | N-α-乙酰轉(zhuǎn)移mei35ELISA試劑盒 |
Neurensin1蛋白ELISA試劑盒 | RAD23同源物BELISA試劑盒 |
雞L丙氨suan解氨mei(PAL) 試劑盒 ELISA | 大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)ELISA Kit |
抗肝腎微粒體抗體ELISA試劑盒 | 人維生suB3(VB3)試劑盒ELISA |
人卵清蛋白特異性IgG(OVAsIgG)檢測(cè)試劑盒elisa | N-乙酰轉(zhuǎn)移mei6ELISA試劑盒 |
人血管生成抑制因子(Arresten)ELISA試劑盒 | 牛蒡子染料法PCR鑒定試劑盒 |
克羅諾桿菌通用PCR試劑盒 | 人注意缺陷多巴胺載脂蛋白基因多態(tài)性PCR檢測(cè)試劑盒 |
產(chǎn)suan克雷伯菌PCR試劑盒 | 人皰疹病毒6B型PCR試劑盒 |
唾液鏈球菌PCR檢測(cè)試劑盒 | 卡薩諾爾森林病病毒RT-PCR試劑盒 |
利什曼原蟲PCR檢測(cè)試劑盒 | NSE 大鼠神經(jīng)特異性烯醇化ELISA檢測(cè)試劑盒 |
CH50 豚鼠血清總補(bǔ)體ELISA檢測(cè)試劑盒 | 克羅諾桿菌通用PCR試劑盒 |
cGMP 小鼠環(huán)磷suan鳥苷ELISA檢測(cè)試劑盒 | 人乳頭瘤病毒高危型PCR檢測(cè)試劑盒 |
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