蛋白質(zhì)引入巰基后修飾及二硫鍵上的定點修飾

二硫鍵上的定點修飾

    很多蛋白質(zhì)中半胱氨酸都是以二硫鍵的形式存在，將二硫鍵還原為兩個游離的巰基，再用雙反應(yīng)性的聚乙二醇化試劑進(jìn)行修飾，可形成一種三碳橋結(jié)構(gòu)（如圖），能替代二硫鍵起穩(wěn)定修飾產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)的作用，對活性影響很小。用該方法修飾干擾素 α-2b（IFN）時，發(fā)現(xiàn)修飾產(chǎn)物 PEG-IFN 的生物活性與 PEG 的長度無關(guān)，比其他位點的聚乙二醇修飾收率高，成本低?？乖Y(jié)合片段（Fab）在血液循環(huán)中迅速消除，是聚乙二醇化修飾的良好對象。Khalili 等合成了PEG-雙砜試劑，能特異性地將二硫鍵末梢定位到 Fab 的結(jié)合區(qū)。對貝伐珠單抗、雷珠單抗、曲妥珠單抗等水解得到的 Fab 進(jìn)行 PEG 化，離子交換色譜純化后得到純的 PEG-Fab 產(chǎn)品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）未檢測到 PEG 損失。用表面等離子體共振（SPR）進(jìn)行比較結(jié)果研究表明：（1）Fab 和用于定點聚乙二醇修飾的 PEG 雙烷基化試劑匹配良好；（2）PEG-Fab 只在表面親和力下降了 2 倍，而解離速率沒有任何變化；（3） PEG 相對分子質(zhì)量變化時，表面結(jié)合速率和親和力保持不變。

單點突變引入巰基后的修飾

    何燕等將比伐盧定（BVLD）多肽鏈 7-甘氨酸（Gly）用半胱氨酸（Cys）取代，用聚乙二醇定點修飾巰基，采用多肽固相合成法制得 [Cys]7-BVLD，其與不同相對分子質(zhì)量的 mPEG-MAL 偶聯(lián)合成了 3 個聚乙二醇化比伐盧定衍生物：[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD、[Cys(mPEG 5000-MAL)]7-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD，這些衍生物的結(jié)構(gòu)經(jīng) MS 確證。凝血酶原時間和凝血酶時間評價結(jié)果表明，3 個衍生物均表現(xiàn)出良好的抗凝活性，尤其是[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD 的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定。

    安群星等選擇天花粉蛋白（TCS）分子上可能的抗原決定簇位點 KR173-174 進(jìn)行定點突變，并將所構(gòu)建的突變體 TCS KR173-174 在大腸桿菌中表達(dá)及純化。通過該突變體第 173 位引入的半胱氨酸殘基進(jìn)行 PEG 定點修飾。結(jié)果表明，所構(gòu)建的突變型 TCS（mTCS）的活性與野生型 TCS（wTCS）活性相當(dāng)，而免疫原性已顯著降低。PEG 修飾型 TCS 雖活性稍低，但其免疫原性、急性毒性以及藥動學(xué)性質(zhì)得到顯著提升。表明通過基因工程及化學(xué)修飾方法改造 TCS 可行，所構(gòu)建的突變型及 PEG 修飾型 TCS 值得進(jìn)一步研究。

    黃湘鷺等利用蛋白質(zhì)分子同源模建，選擇在集成干擾素分子 IIFN 的第 72 位引入半胱氨酸殘基構(gòu)成集成干擾素突變體 IIFN72C。誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)包涵體變復(fù)性和柱色譜純化，與 mPEG-MAL 定點偶聯(lián)。結(jié)果表明，IIFN72C 以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的 30%以上，比活性與突變前相當(dāng)，修飾產(chǎn)物大多數(shù)為單修飾體，純化后質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，比活性保留約為修飾前的 8%。

   治療嚴(yán)重痛風(fēng)的一種方法是注射非人類尿激酶，以減少體內(nèi)尿酸水平。pegloticase 是一種聚乙二醇化的豬–狒狒嵌合尿激酶，用于慢性難治性痛風(fēng)，但會產(chǎn)生較多的過敏反應(yīng)，此外，還有一些皮膚紅腫、便秘、胸痛和嘔吐等副反應(yīng)，這些限制了它的應(yīng)用和效果。Nyborg 等^[16]研制了一種治療性的尿激酶，在 200 個代表不同 HLA 單體的人體樣本中，免疫原性較低，將半胱氨酸設(shè)計到該序列中，用聚乙二醇定點修飾，效率能達(dá)到 95%。聚乙二醇尿激酶在體外，中性 pH 值條件下，在人體血漿中以及鼠類和犬類體內(nèi)的酶活性保持不變。在犬身上，皮下注射能使血漿中尿酸水平降低 85%。這種聚乙二醇化的非免疫原性尿激酶將為痛風(fēng)患者帶來極大的幫助。

    葡激酶（SAK）是一種細(xì)菌來源的、具有良好靶向性和溶栓活性的蛋白，擁有極大應(yīng)用潛力，但在生物體內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)，血漿半衰期短（僅3min）。根據(jù) SAK 晶體結(jié)構(gòu)及抗原位點選擇突變位點，構(gòu)建突變質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)半胱氨酸（Cys）突變蛋白 S-cys；對目的蛋白在不同條件下進(jìn)行聚乙二醇修飾^[17]，純化后得到較高純度的修飾蛋白 PEG-S-cys，通過纖維蛋白平板溶圈實驗和動物栓塞模型的構(gòu)建初步對其生物活性進(jìn)行驗證。結(jié)果表明所得 PEG-S-cys 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 90%， PEG-S-cys 具有溶栓活性，這為葡激酶的改造提供了一種新的方法與思路。

多點突變引入巰基后的修飾

    梁凌宇等采用分子生物學(xué)技術(shù)經(jīng)點突破得到rhCNTF 突變體 CN10，運用 mPEG-MAL 對 CN10進(jìn)行定點修飾，每 2 天 ip 一次 PEG 化的 CN10，對小鼠體質(zhì)量的增長抑制率可達(dá) 50%，與每天注射 2次rhCNTF 的體質(zhì)量增長抑制作用相當(dāng)，說明 CN10蛋白在 PEG 化修飾后，其減重效應(yīng)持續(xù)時間可明顯延長。馮翠等則采用 mPEG-MAL 對 rhCNTF 的第 17 位半胱氨酸巰基進(jìn)行定點修飾，實驗結(jié)果表明，在 pH 7.5 的 Tris-HCl 緩沖溶液中，蛋白質(zhì)與修飾劑的比例為 1∶3，4 ℃下反應(yīng) 12 h，修飾率可達(dá)到90%以上，修飾混合物通過一步陰離子交換色譜可獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98%以上的單修飾產(chǎn)物。熒光光譜和圓二色圖譜顯示 mPEG-CNTF-C17 與原蛋白二、三級結(jié)構(gòu)一致。細(xì)胞增殖活性檢測表明，mPEG-CNTF-C17 的比活達(dá)到了 6.51×10⁵ IU/mg，體內(nèi)循環(huán)半衰期相對原蛋白提高了 30.3 倍。該研究為開發(fā) CNTF 長效產(chǎn)品提供了基礎(chǔ)。

    為獲得高抗菌活性聚乙二醇定點修飾的溶葡萄球菌酶（Lysn），根據(jù)該酶的結(jié)構(gòu)，在它的催化域和結(jié)合域上優(yōu)選 8 個位點（Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240 和 T244），分別突變成半胱氨酸，純化后的溶葡萄球菌酶突變體經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）處理后與 mPEG-MAL 進(jìn)行定點修飾反應(yīng)，RP-HPLC 分析顯示 PEG 修飾率大于 70%，修飾產(chǎn)物經(jīng) MacroCapSP 陽離子交換層析純化后，PEG 化溶葡萄球菌酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 95%。比濁法和小抑菌濃度（MIC）實驗表明 20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C 的抗菌活性維持在原來的50%左右。研究結(jié)果為溶葡萄球菌酶全身給藥治療金黃色葡萄球菌感染奠定了基礎(chǔ)。

通過 Traut 試劑引入巰基后的修飾

    為了構(gòu)建 trastuzumab（TMAB）–聚乙二醇–PARAM 靶向遞藥系統(tǒng)，馬鵬凱等以雙功能聚乙二醇為連接子，并在 trastuzumab 上通過 Traut 試劑引入巰基。通過琥珀酸酐共價連接在 PAMAM 表面，由于酯鍵比較穩(wěn)定，藥物緩慢釋放；隨后再在PAMAM 表面共價結(jié)合雙功能聚乙二醇 NHS-PEG-MAL，延長其在血液循環(huán)的時間，增強 EPR 效應(yīng)，提高藥物在腫瘤部位的濃度，后 PEG 末端連接巰基化的 TMAB，利用與 HER2 受體的作用提高進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的藥物濃度，達(dá)到持續(xù)、有效、安全的腫瘤治療策略。