引言
人促紅細胞生成素(EPO)是一種重要的糖蛋白藥物，廣泛應(yīng)用于治療貧血等疾病。EPO可以結(jié)合紅系祖細胞上的相應(yīng)受體促進紅細胞的生成，抑制其凋亡，增加紅細胞的數(shù)量，從而增加機體的氧氣運輸能力。然而，EPO的療效和安全性與其N-連接糖基化(N-glycosylation)密切相關(guān)。N糖結(jié)構(gòu)的微小變化可能直接影響EPO的生物學活性、穩(wěn)定性和免疫原性。[1,2]因此，N糖測定成為EPO質(zhì)量控制中不可少的一環(huán)。今天，我們就來聊聊N-糖測定的重要性，以及高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)在這一領(lǐng)域中的優(yōu)勢。
圖1. EPO的結(jié)構(gòu)
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1. EPO的N糖測定為何如此重要？
a 影響生物學活性
EPO的N糖結(jié)構(gòu)直接影響其與紅細胞生成素受體的結(jié)合能力，進而調(diào)控其生物學活性。EPO的3個N-糖鏈均可包含2-4個分支，每個分支末端均可為帶負電的唾液酸，O-糖鏈也可帶有最多2個唾液酸，這些唾液酸決定了整個分子的整體負電荷，也導致了促紅素整體復雜的電荷異質(zhì)性。唾液酸摩爾數(shù)量的增加可以增加促紅素的半衰期。
b 決定藥代動力學特性
N糖鏈中的唾液酸含量與EPO在體內(nèi)的半衰期密切相關(guān)。唾液酸化程度高的EPO能夠避免被肝臟快速清除，從而延長藥效。
c 確保穩(wěn)定性和安全性
N糖鏈可以保護EPO分子免受降解，并降低其免疫原性。如果N糖結(jié)構(gòu)異常，可能導致EPO聚集或引發(fā)免疫反應(yīng)，影響治療效果。
d 監(jiān)控生產(chǎn)工藝一致性
N糖糖譜是EPO質(zhì)量控制的重要指標，能夠反映生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的一致性。
2. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測定的流程
圖2. EPO的N糖測定流程
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a 樣品前處理流程：
● 酶解 取供試品適量，用磷酸鹽緩沖液置換供試品的緩沖體系并制成每 1ml 約含人促紅素蛋白 2.0mg 的溶液。取 100μl，加糖苷酶F溶液 4μl，混勻，置 37℃保溫 16 小時。
● 除蛋白 加入-20℃預(yù)冷的乙醇 0.3ml，混勻，置-20℃至少 30 分鐘，于 4℃不低于14000g 離心 15 分鐘，取上清液，必要時采用適宜方式除鹽后真空干燥，加水 0.20ml 復溶。
b 儀器配置及色譜條件：
儀 器：Dionex™ ICS-6000 型離子色譜儀
色譜柱：Dionex™ CarboPac™ PA200 色譜柱；
柱 溫：30℃；
淋洗液：以50mmol/L 氫氧化鈉溶液為流動相 A，以 0.2mol/L 氫氧化鈉溶液為流 動相 B，以含有 50mmol/L 氫氧化鈉溶液和 0.25mol/L 乙酸鈉溶液為 流動相 C，梯度洗脫；
流 速： 0.5ml/min；
檢測器：脈沖安培檢測器，金工作電極，Ag-AgCl參比電極，糖四電位波形。
圖3. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定EPO中的N糖糖譜(點擊查看大圖)
3. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測定的優(yōu)勢
高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)是目前EPO N-糖和唾液酸測定中尤其常用的技術(shù)之一。它的核心優(yōu)勢在于：
a) 前處理簡單
該方法不需衍生，酶解后的樣品可直接進樣，省時省力。
b) 高靈敏度檢測
脈沖安培檢測器(PAD)對糖類物質(zhì)具有很高的靈敏度，無需復雜的樣品前處理或衍生化步驟，即可實現(xiàn)微量糖鏈的精準檢測。
c) 高效分離
HPAEC-PAD利用陰離子交換色譜柱，能夠高效分離復雜糖鏈，即使是結(jié)構(gòu)相似的N-糖鏈也能清晰區(qū)分。
d) 定量分析能力強
HPAEC-PAD不僅可以定性分析N糖鏈的結(jié)構(gòu)，還能精確測定各糖鏈的相對含量，為EPO的質(zhì)量控制提供可靠數(shù)據(jù)。
e) 可與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用
HPAEC與高分辨制質(zhì)譜聯(lián)用，可以實現(xiàn)單個N糖的結(jié)構(gòu)確證。
4. HPAEC-PAD用于唾液酸的含量測定
EPO的不均一性很大程度上是由糖鏈末端唾液酸化引起的，唾液酸化程度的高低直接影響著促紅素蛋白的體內(nèi)半衰期，與EPO的生物學體內(nèi)活性息息相關(guān)，是重要的質(zhì)控指標。HPAEC-PAD對唾液酸同樣有良好的檢測能力。
圖4. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定EPO中的唾液酸含量(點擊查看大圖)
a) 與間苯二酚法相比【3】
優(yōu)勢：HPAEC-PAD法靈敏度和專屬性更高，可同時測定不同結(jié)構(gòu)操作簡單。
局限：HPAEC-PAD法較間苯二酚法成本較高。
b) 與液相色譜法（HPLC）相比
優(yōu)勢：HPAEC-PAD測定唾液酸不需衍生，前處理更簡單，節(jié)省時間和試劑，結(jié)果更準確。
局限：離子色譜不及液相色譜普及。
5. 總結(jié)
EPO的N糖糖譜和唾液酸測定是確保其質(zhì)量、安全性和有效性的關(guān)鍵步驟，而HPAEC-PAD憑借其高分辨率、高靈敏度和強大的定量分析能力，成為這一領(lǐng)域尤其高效的技術(shù)。無論是科研還是生產(chǎn)，HPAEC-PAD都為EPO的N糖分析和唾液酸分析提供了可靠的技術(shù)支持。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，HPAEC-PAD有望在更多生物制品的質(zhì)量控制中發(fā)揮更大作用！
互動話題：
你對EPO的N糖測定還有哪些疑問？或者你對HPAEC-PAD技術(shù)有什么看法？歡迎在評論區(qū)留言討論！
參考文獻：
1. 李響,秦璽,裴德寧,等. 促紅素N-糖鏈的超高壓液相色譜分析方法驗證[J]. 中國新藥雜志,2024,33(6):598-604.DOI:10.3969/j.issn.1003-3734.2024.06.012.
2. 李響,于雷,范文紅,等. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法用于重組人促紅素中唾液酸的含量測定[J]. 中國醫(yī)藥導報,2018,15(27):102-105.
3. 《中國藥典》2020年版
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