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新國標(biāo)應(yīng)對—GB 5009.299-2024 食品中乳鐵蛋白的測定

來源:賽默飛世爾科技(中國)有限公司   2025年02月14日 16:50  
引   言
 
  生牛乳中富含多種天然活性蛋白,如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳過氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等,這些天然活性蛋白在抵抗細(xì)菌、病毒入侵,增強免疫力,促進(jìn)組織修復(fù)和生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。其中乳鐵蛋白能夠參與機(jī)體鐵代謝,促進(jìn)體內(nèi)鐵元素的吸收和運輸,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力的功能。不同的熱處理方式(巴氏殺菌、超高溫 (UHT) 滅菌、蒸發(fā)濃縮及噴霧干燥等),會導(dǎo)致乳制品中乳鐵蛋白出現(xiàn)不同程度的變性失活,從而影響其營養(yǎng)價值及市場售價。

 

 
賽默飛新國標(biāo)應(yīng)對方案亮點
 
  1.本試驗參考 GB 5009.299-2024、NY/T 4439-2023 以及相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn),對巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量進(jìn)行測定。
 
  2.為獲得良好的峰形和分離度,試驗對樣品前處理和液相色譜條件進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化,在柱溫 30 ℃、流速 1.0 mL/min 條件下,以 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動相進(jìn)行梯度洗脫,系統(tǒng)最大壓力值不超過 106 bar。
 
  3.試驗結(jié)果表明:乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 色譜峰不對稱因子 1.00,峰形良好,理論塔板數(shù) 30549,柱效優(yōu)異;連續(xù)三次進(jìn)樣,保留時間和峰面積的 RSD 均小于 1%,方法重現(xiàn)性好;線性低點 (1.00 μg/mL) 信噪比為 8.2,方法靈敏度較高;線性范圍 1.00-200 μg/mL,線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9998,線性良好。
 
  4.在反相液相色譜法測定乳制品中乳鐵蛋白含量的試驗中,BioBasic 4 色譜柱(孔徑 300 Å)配合 Vanquish Core 高效液相色譜系統(tǒng),表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性和優(yōu)異的穩(wěn)定性,方法檢出限和定量限均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,可供乳制品企業(yè)及食品檢測實驗室參考。

GB 5009.299-2024
賽默飛完整應(yīng)用解決方案

 
01
 
  樣品前處理
 
  1.1 試樣提取
 
  1.1.1 液體試樣:低溫奶(生牛乳、巴氏殺菌乳)/ 常溫奶(超高溫 (UHT) 滅菌乳)
 
  稱取試樣 5 g(精確到 0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中,用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 25.0 mL,渦旋振蕩提取 3 min,12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置,去除上層浮脂,取上清液待凈化。
 
  1.1.2 固體試樣:乳粉(嬰幼兒配方奶粉)
 
  稱取試樣 2 g(精確到 0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中,加適量磷酸鹽緩沖液Ⅱ溫?zé)嵴駬u溶解,用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 50.0 mL,渦旋震蕩提取 3 min ,靜置 30 min 以上,12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置,去除上層浮脂,取上清液待凈化。

  1.2 試樣凈化
 
  1.2.1 活化:HyperSep 肝素親和柱 (P/N: 60105-110-B) 下端 Luer 接頭連接至固相萃取裝置,上端通過適配器 (P/N: 60104-259) 串聯(lián) 10 mL 注射器空筒, 加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ活化肝素親和,控制滴速 2d/3s;
 
  1.2.2 上樣:待活化步驟液面接近小柱篩板時,準(zhǔn)確移取 10.0 mL 上述樣液至注射器空筒 (P/N: S7510-10) 中,控制滴速 2d/3s,棄去流出液;
 
  1.2.3 淋洗:待上樣步驟液面接近小柱篩板時,加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ淋洗小柱,棄去流出液,移除適配器和注射器空筒,負(fù)壓抽干小柱 2 min;
 
  1.2.4 洗脫:加入 2×2.5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅰ洗脫,收集全部洗脫液,并用磷酸鹽緩沖液Ⅰ定容至 5.00 mL,過 0.2 μm 親水性 PTFE 針式過濾器 (P/N: 42213-NPL) ,濾液待上機(jī)測試。

02
 
  儀器配置及色譜條件
 
  Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色譜系統(tǒng),配置:泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A),自動進(jìn)樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A),柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A),檢測器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A),數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
 
  色譜柱:BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 72305-254630)
 
  流動相:A: 0.1% 三氟乙酸水 B: 0.1% 三氟乙酸乙腈
 
  流速:1.0 mL/min
 
  梯度洗脫程序:

 

 
  進(jìn)樣量:50 µL
 
  柱溫:30 ℃
 
  檢測器:DAD, 采集波長: 280 nm;采集頻率: 5 Hz;光譜采集: 190-400 nm

03
 
  譜圖及數(shù)據(jù)
 
  3.1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù)

圖 1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù) (50.0 μg/mL)(點擊查看大圖)

 
  如圖 1 所示,乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 保留時間為 12.137 min,色譜峰形良好,不對稱因子 1.00,柱效優(yōu)異,理論塔板數(shù) 30549。乳鐵蛋白在 280 nm 處有特征吸收峰。
 
  3.2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖

圖 2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖 (50.0 μg/mL, n=3)(點擊查看大圖)

 
  乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 連續(xù)三次進(jìn)樣,保留時間和峰面積的 RSD 均小于 1%,方法重現(xiàn)性好,分離譜圖及數(shù)據(jù)詳見圖 2。
 
  3.3 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖

圖 3 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖 (1.00/5.00/10.0/50.0/100/200 μg/mL)(點擊查看大圖)

 
  如圖 3 所示,乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性范圍 1.00-200 μg/mL,線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9998,線性良好。
 
  3.4 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性最低點與空白溶液疊加譜圖

圖 4 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性最低點 (1.00 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖(點擊查看大圖)

 
  當(dāng)進(jìn)樣體積為 50 uL 時,以乳鐵蛋白 (1.00 μg/mL) 的峰高為 S,選取 10.5-11.5 min 基質(zhì)噪音的平均值為 N,線性低點信噪比 S/N=8.2,如圖 4 所示,乳鐵蛋白測定方法靈敏度相對較高。
 
  3.5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動相體系下,乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰形及響應(yīng)

圖 5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動相體系下,乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溶液疊加譜圖(點擊查看大圖)

 
  如圖 5 所示,當(dāng)流動相 B 為純乙腈時,乳鐵蛋白峰形會出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾,導(dǎo)致線性最低點 (1.00 μg/mL) 響應(yīng)較差,無法自動積分,方法檢出限不能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。綜合乳鐵蛋白行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 4439-2023 和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) T/TDSTIA 006-2019 推薦的色譜條件,本試驗最終選擇 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動相進(jìn)行梯度洗脫,且系統(tǒng)最大壓力值不超過 106 bar。
 
  3.6 巴氏殺菌乳(低溫奶)、超高溫滅菌乳(常溫奶)及嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖

圖 6 巴氏殺菌乳(低溫奶)樣品溶液分離譜圖(點擊查看大圖)

 

 

 
圖 7 超高溫滅菌乳(常溫奶)樣品溶液分離譜圖(點擊查看大圖)
 

 

 
  圖 8 嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)(點擊查看大圖)
 
  乳鐵蛋白對溫度非常敏感‌,高溫會破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性,使得肝素親和柱無法有效富集。如圖 6-8 所示,巴氏殺菌乳(低溫奶)中乳鐵蛋白含量為 13.4 mg/kg;而超高溫滅菌乳(常溫奶)和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白均為未檢出。
 
04
 
  GB 5009.299-2024 相關(guān)色譜耗材推薦
 
分析柱及保護(hù)柱
 
BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm
 
(P/N: 72305-254630)
 
BioBasic 保護(hù)柱柱芯, 5 μm, 4.0×10 mm, 4 pk
 
(P/N: 72305-014001)
 
Uniguard 直連式保護(hù)柱柱套
 
(P/N: 850-00)
 
樣品前處理
 
HyperSep 肝素親和柱,3 mg, 10/pk
 
(P/N: 60105-110-B)
 
HyperSep 玻璃室真空固相萃取裝置,16 位
 
(P/N: 60104-232)
 
適配器,適用于 1 mL、3 mL、6 mL SPE 小柱轉(zhuǎn)接,15/pk
 
(P/N: 60104-259)
 
National Target 全塑料一次性注射器,Luer-Slip, 10 mL, 100/pk
 
(P/N: S7510-10)
 
Titan 3 親水性 PTFE 針式過濾器,17 mm, 0.2 μm, 200/pk
 
(P/N: 42213-NPL)

05
 
  參考文獻(xiàn)
 
  [1] GB 5009.299-2024 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中乳鐵蛋白的測定
 
  [2] NY/T 4439-2023 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定 高效液相色譜法
 
  [3] T/TDSTIA 006-2019 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定 液相色譜法
 
  [4] T/CCAA 70-2023 牛乳基嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

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