單細胞組學
單細胞組學研究在揭示細胞群體異質性、發(fā)現(xiàn)單個細胞的獨特性以及識別所關注的少數(shù)亞群等方面發(fā)揮至關重要的作用，近年來受到越來越多的關注[1]。蛋白質作為生命活動的直接執(zhí)行者，由于氨基酸組成的不同、可變剪切以及翻譯后修飾狀態(tài)的不同給蛋白質帶來了豐富的多樣性，在蛋白質層面對生理活動的多樣性和復雜性的揭示，逐漸成為探索生命活動進程的焦點[2]。近年來，隨著單細胞RNA測序等技術的突破，在單細胞層面深入研究基因組和轉錄組成為現(xiàn)實。高通量單細胞轉錄組測序技術不僅揭示了細胞之間的異質性，還保留了傳統(tǒng)群體研究中所發(fā)現(xiàn)的共性問題，這有助于我們更加全面地理解細胞的功能和調控機制[1]。但由于遺傳物質與蛋白表達含量之間并不是一一對應的定量關系，單細胞轉錄組數(shù)據(jù)可以提供基因表達的信息，但無法直接推斷出蛋白質含量的變化。此外，由于細胞內轉錄和翻譯在時空上的差異性，以及翻譯后修飾對蛋白質調控等因素，使得對單細胞開展蛋白質組學研究成為一個必要且迫切的需求。單細胞蛋白質組學能夠提供每個細胞中蛋白質及其翻譯后修飾的定量信息，為解析生命活動在單細胞層面上的奧秘提供了新途徑和新見解[3]。
由于單細胞中所表達的蛋白含量極低且不同的細胞之間蛋白表達量也差異極大，如下圖A所示，單個細胞中蛋白質的含量整體在pg-ng級別，一個精子中蛋白的總量在18pg左右，一個HeLa細胞則含有約250 pg蛋白質，且不同于遺傳物質可以擴增，蛋白質本身無法進行數(shù)量的擴增放大，因此樣品前處理損失和檢測儀器的靈敏度極大地限制了單細胞蛋白質組學研究的發(fā)展[3]。近年來，隨著樣品前處理技術和色譜-質譜聯(lián)用儀器性能的不斷進步，單細胞蛋白質組學研究經(jīng)歷了深度與廣度的巨大變化[3]。2018年Rayn T. Kelly團隊基于nanoPOTS玻璃芯片這一蛋白質前處理技術通過減小反應體積而減少樣本損耗，在單細胞中鑒定到了超過600個蛋白質[4]。2020年Zhu Ying團隊則進一步利用熒光激活細胞分選(FACS)實現(xiàn)對單細胞的分選，利用串聯(lián)質譜標簽(TMTs)結合ThermoFisher的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀在nanoPOTS蛋白前處理技術下成功從單細胞中鑒定到了超過1716個蛋白[5]。2023年，Karl Mechtler團隊則利用CellenONE平臺進行單細胞分選，并使用proteoCHIP芯片進行蛋白質前處理，在Orbitrap Exploris 480-FAIMS質譜儀系統(tǒng)上實現(xiàn)單細胞1940個蛋白的鑒定[6]。時間進入到2024年，浙江大學方群團隊則利用微流控技術開發(fā)PiSPA單細胞分選技術，結合高靈敏度質譜分析，在單個哺乳動物細胞中檢測到最多3 000個蛋白質[7]。同年，Jesper V. Olsen團隊利用其開發(fā)的Chip-Tip方法單細胞蛋白前處理策略集合ThermoFisher的全新一代Orbitrap Astral質譜儀系統(tǒng)將單細胞蛋白組鑒定深度帶入一個全新的境界。利用Chip-Tip 方法，結合CellenONE高通量的從細胞懸液中分選單細胞，并在proteoCHIP-EVO96中進行后續(xù)蛋白質處理，結合Orbitrap Astral的窄窗口 DIA(nDIA)方法能夠穩(wěn)定的在單HeLa細胞水平鑒定到超過5 000種蛋白質，實現(xiàn)單細胞水平全面的蛋白質組學研究[8]。
圖1 單細胞蛋白質含量與蛋白質鑒定數(shù)量的圖示
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綜上所述，隨著單細胞樣品前處理技術以及高端質譜檢測器性能的突飛猛進，目前單細胞蛋白質組檢測在技術層面的難題已近于克服，當前單細胞層面蛋白質檢出數(shù)量已達到一個全新高度，單細胞蛋白質組學在技術上的進步已使得我們能夠以與此前完全不同的視角去研究原有的生物學問題，并與單細胞基因組、轉錄組及代謝組等研究方法互為補充，極大地拓展了我們探索生命奧秘的技術手段。單細胞蛋白質組檢測在技術上的突破也使得在單細胞層面開展蛋白質翻譯后修飾鑒定成為一種可能，然而，盡管技術進步迅速，但由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測方案等因素的存在，在單細胞水平上對其進行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。目前針對單細胞進行修飾組學鑒定的報道還較少，為此，本文將針對兩篇單細胞修飾鑒定佳作展開介紹，以期為各位讀者開展相關研究工作提供思路。
文章一
第一篇文章來自于丹麥哥本哈根大學Jesper V. Olsen團隊的葉子璐博士，目前葉子璐博士已任中國醫(yī)學科學院系統(tǒng)醫(yī)學研究院蘇州系統(tǒng)醫(yī)學研究所研究員[8]。如前所述，單細胞蛋白質組學樣品制備工作流程的關鍵考慮因素包括盡可能保持樣品濃縮以減少表面吸附損失，減少緩沖液蒸發(fā)和移液步驟以提高重現(xiàn)性并最大化檢測靈敏度[8]。有基于此，作者開發(fā)了一種近乎無損的基于 LFQ單細胞蛋白質組工作流程，作者專為單細胞樣品制備設計了名為proteoCHIP EVO 96的芯片，能夠以納升水平的最小體積運行，可同時并行制備多達 96 個蛋白質組學樣品，該芯片專門針對與 Evosep One LC 系統(tǒng)的兼容性進行了定制，實現(xiàn)了無需額外移液步驟的簡化樣品轉移過程。利用CellenONE高通量單細胞分選設備及proteoCHIP EVO 96前處理技術，結合Orbitrap Astral的窄窗口DIA(nDIA)方法, 顯著提高了單細胞蛋白質組分析的靈敏度和效率(圖 2A)。
作者通過比較分析確定了最佳的 nDIA 方法，發(fā)現(xiàn)使用 4Th DIA 窗口以及6ms 最大離子注入時間(4Th6ms)可獲得最高的蛋白質組覆蓋度，并實現(xiàn)在單個 HeLa 細胞中中位數(shù)為 5204 種蛋白質的鑒定水平，并在其中一次 HeLa 細胞制備中鑒定出超過 6000 種蛋白質(圖 2B)。當進一步擴大細胞的數(shù)量，能夠從僅 20個細胞的樣品總鑒定出超過 7000 種蛋白質。在肽段水平上實現(xiàn)的深度鑒定則更為顯著，單細胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 41700，20個細胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 98054(圖 2C)，單細胞的蛋白質序列中位覆蓋度為 12.9%，20個細胞樣品的為 25%(圖 2D)。這種高深度的肽段覆蓋也促進了高度準確的蛋白質定量，基于iBAQ值的強度絕對定量顯示出跨越約五個數(shù)量級的廣泛動態(tài)范圍，相對蛋白質豐度估計也表明，不同細胞數(shù)量樣品的 iBAQ 值幾乎呈線性關系(圖 2E)。作者也開展了不同亞細胞定位蛋白的鑒定統(tǒng)計，其中穩(wěn)定鑒定出超過 200 種質膜蛋白，也進一步說明了該方法的穩(wěn)健性(圖 2F)。
圖2 高通量無標記單細胞蛋白質組學的工作流程及結果
(A) 單細胞分離和蛋白質組學處理工作流程的示意圖。(B) 使用不同的 nDIA 設置在單個、10 個、20 個和 40 個 HeLa 細胞中鑒定的蛋白質數(shù)量。(C) 使用不同的 nDIA 設置在單個、10 個、20 個和 40 個 HeLa 細胞中鑒定的肽段數(shù)量。(D) 單細胞、10 細胞和 20 細胞樣品的蛋白質序列覆蓋百分比。(E) 顯示不同細胞數(shù)量下定量范圍和一致性的 iBAQ 值分布。(F) 細胞區(qū)室中蛋白質定位的概述。搜索使用了 Spectronaut(v18)(點擊查看大圖)
鑒于作者開發(fā)的近乎無損的基于 LFQ單細胞蛋白質組工作流程在肽段前體水平所實現(xiàn)的高深度覆蓋鑒定，這不僅增強了蛋白質鑒定和定量，還可能揭示大量與翻譯后修飾相關的信息。為了驗證這一假設，作者在單細胞蛋白質組樣品中深入研究了兩種具有極高細胞重要性的翻譯后修飾-磷酸化和糖基化，蛋白質磷酸化作為一種非常重要的翻譯后修飾，在細胞凋亡、炎癥、代謝、增殖、蛋白質運輸?shù)榷喾N生物學過程中發(fā)揮重要的調控功能[9]，磷酸化信號級聯(lián)是生物體信號傳導的關鍵分子機制，因此開展磷酸化蛋白質組學研究一直是生命科學研究中的熱點之一。N-糖基化是蛋白質一種普遍且重要的翻譯后修飾，它介導了包括細胞間識別、信號轉導、免疫反應以及疾病發(fā)生和發(fā)展等多種關鍵生物學過程。在許多惡性腫瘤和其他疾病中都發(fā)現(xiàn)了 N-糖基化譜的改變，因此全面表征蛋白質 N-糖基化對于增進我們對健康和疾病的理解至關重要[10]。為此，作者對該兩種翻譯后修飾開展不進行任何特定富集的單細胞位點鑒定。
作者專注實現(xiàn)催化磷酸化反應的激酶的發(fā)現(xiàn)，基于開發(fā)的單細胞蛋白質方案在不進行任何修飾富集的情況下，在單細胞內定量了 168 種蛋白激酶，涵蓋了所有主要的激酶家族(圖 3A)。值得注意的是，來自 CMGC 組的 CDK1 和來自 STE 組的 MAPK1 等激酶表現(xiàn)出最高的豐度，而酪氨酸激酶則較少。隨后，作者在單細胞樣品中以絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸磷酸化為可變修飾進行數(shù)據(jù)庫搜索，并使用 20 個細胞樣品作為載體蛋白質組(carrier proteome)。盡管沒有進行任何特定的細胞刺激或樣品處理來保留磷酸化位點，但該搜索方法依然在單細胞中可靠地鑒定出120個絲氨酸、28個蘇氨酸和 13個酪氨酸磷酸化位點(圖 3B)。motif分析顯示出常見的磷酸化基序，這與我們的激酶組數(shù)據(jù)高度一致(圖 3C)。重要的是，對酪氨酸磷酸化在 m/z 216.042 處的選擇性亞銨離子的 DIA-MS/MS 光譜的提取離子色譜圖(XIC)篩選顯示，在整個 LC 洗脫曲線中存在強烈信號(圖 3D)。作者還研究了蛋白質糖基化模式，并在所有糖基化途徑中檢測到多種糖基轉移酶(圖 3E)。采用類似于磷酸酪氨酸亞銨離子篩選的策略，作者對常見聚糖進行了氧鎓離子篩選，包括單糖 HexNAc(圖 3F)和 NeuAc(圖 3G)以及二糖 Hex-HexNAc(圖 3H)。所有聚糖都大量存在，并且在大多數(shù) MS2 光譜中都能檢測到，即使使用 nDIA 也是如此。亞銨離子和氧鎓離子的篩選表明，蛋白翻譯后修飾(如磷酸化和糖基化)在單細胞中普遍存在。
作者的研究證明了在無需特定富集方案的前提下進行翻譯后修飾分析的可行性。這一進展為更簡化、高效地探索翻譯后修飾位點乃至開展組學鑒定鋪平了道路，揭示了細胞內發(fā)揮作用的多方面調控機制。然而，由于當前數(shù)據(jù)庫搜索算法的限制，修飾肽段的精確鑒定仍然具有挑戰(zhàn)性。
圖3 單細胞蛋白質組學中的翻譯后修飾分析
(A) 激酶組樹狀圖，展示了單細胞中主要激酶家族的 168 種激酶的定量情況，節(jié)點顏色和大小表示 iBAQ 豐度。(B) 柱狀圖，描繪了單細胞和 20 細胞樣品中鑒定的絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)殘基的磷酸化位點數(shù)量。(C) 序列標志分析，說明了在單細胞樣品中鑒定的最常見的磷酸化基序。(D) 磷酸酪氨酸(m/z 216.0426)的亞銨離子在液相色譜洗脫曲線中的提取離子色譜圖(XIC)。(E) 單細胞中鑒定的糖基因的可視化。(F) HexNAc(m/z 204.087)的氧鎓離子的 XIC，表明聚糖在 MS2 光譜中的存在。(G) NeuAc(m/z 274.092)的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度。(H) 二糖 Hex-HexNAc(m/z 366.139)的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度(點擊查看大圖)
文章二
在自下而上的蛋白質組學研究中，常用的定量策略包括非標記定量(lable free quantification，LFQ)和同位素標記定量(isotope labeling quantification)。單細胞蛋白質組學中的早期經(jīng)典方法之一是基于串聯(lián)質譜標簽(TMTs)的同位素標記定量解決方案SCoPE-MS。Slavov 團隊在 2018 年開發(fā)了基于 TMT 標記的單細胞蛋白質組分析方法，利用了 TMT 載體(TMT-carrier)的概念 。在該策略中，通過將單細胞通道和使用大量細胞的 TMT 載體通道(TMT-carrier channel)的信號相結合，大幅提高了肽段的 MS1 強度，從而觸發(fā)了顯著改進的 MS/MS 裂解[11]。實現(xiàn)了肽段鑒定效率的大幅提高，這有助于以更高的靈敏度和通量進行單細胞蛋白質組分析。
鑒于N-糖基化在諸多惡性腫瘤和其他疾病進展中的重要性，在單細胞分辨率下闡明 N-糖基化模式的變化，將極大地促進對其在腫瘤微環(huán)境和免疫治療中關鍵作用的理解?？紤]到單細胞/微量細胞中樣本量極少且與富集方法不兼容，國家蛋白質科學中心(北京)的秦偉捷研究員課題組開發(fā)了一種基于 TMT 標記的完整N-糖肽分析非富集策略(圖4)。該策略并非依賴于單個單細胞/微量細胞樣品中完N-糖肽響應較差的 MS信號強度，而是將使用從大量細胞樣品中獲得的N-糖肽的TMT 載體通道與TMT研究通道中的單細胞/微量細胞混合，且不進行富集，以獲得組合的 MS1 信號。通過這種方式，研究通道可以避免富集步驟中的樣品損失，從而支持在極少量樣品中進行超靈敏的 N-糖肽鑒定。即使在單細胞/微量細胞中非糖肽的干擾下，N-糖肽顯著提高的 MS1 信號也能有效地觸發(fā) MS/MS 裂解，從而促進了對單個以及50 個 HeLa 細胞的首次大規(guī)模定量完整N-糖蛋白組分析。由于單細胞 / 微量細胞樣品未進行富集步驟，該策略不受不同糖型和豐度的 N - 糖肽之間富集效率差異的影響，因此可能導致更準確的定量結果。
圖4 基于 TMT 標記的用于單細胞/微量細胞大規(guī)模N-糖肽鑒定的載體策略(點擊查看大圖)
為了驗證這一概念和策略，作者制備了三個樣品以測試載體策略在不進行富集的情況下從低ng水平樣品中進行深度N-糖肽鑒定的可行性(圖 5A)。如圖 5B 所示，對于樣品 I使用 TMT10 的每個通道(不包括 126、127C 和 128C)標記 50ng HeLa 細胞裂解消化物，并最終將七個通道合并進行質譜分析。對于樣品 II，使用 TMT126(載體通道)標記從 40μg HeLa 細胞裂解消化物中富集的N-糖肽，其余通道留空。樣品III是樣品I和II的組合，以評估在不進行富集的情況下使用載體通道促進研究通道中痕量樣品的 N-糖肽鑒定的可行性。對于沒有載體通道的樣品 I，由于在未富集樣品中其豐度極低，僅鑒定出 112個 N-糖肽。然而，在樣品 III中，通過在通道 TMT126 中添加載體N-糖肽，完整N-糖肽的數(shù)量至少增加了14倍。同樣，樣品 III 中 N-糖肽的總MS 強度也顯著增強(圖 5C)，這表明應用糖載體大大增加了在痕量樣品中鑒定和定量未富集的 N-糖肽的機會。
圖5 糖載體策略的可行性評估
(A) I、II 和 III 實驗中的 TMT 通道分配。(B) 三個樣品中每個樣品的定量 N - 糖肽數(shù)量。(C) N - 糖肽的總強度。
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由于糖肽豐度低、受非糖肽的抑制以及在富集過程中不可避免的樣品損失，使用直接質譜分析或傳統(tǒng)的親水相互作用液相色譜(HILIC)富集方法，從單個和 50個HeLa 細胞中作者均未鑒定出 N-糖肽。然而，使用糖載體策略從單個和 50個HeLa 細胞中分別獲得了超過 260個和 500個N-糖肽，這表明該策略對單細胞 / 微量細胞研究具有高靈敏度(圖 6A)。如圖 6B 所示，在跨越四個數(shù)量級強度范圍的累積曲線中，從七個單個HeLa細胞中共獲得了608個完整的N-糖肽。對于定量分析，當樣品量從 50 ng 減少到單個細胞時，鑒定出的 N-糖肽的強度分布呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(圖 6C)。相比之下，由于基于數(shù)據(jù)依賴采集的質譜分析的隨機性，變異系數(shù)(CV)隨著樣品量的減少而增加，并且通常預計較低的樣品量會有更高的定量波動。然而，少量細胞(10 個和50個細胞)的CV僅略高于50 ng樣品中的CV，這表明糖載體策略具有高重現(xiàn)性。對于單細胞，發(fā)現(xiàn)較高的CV,這可能部分歸因于單個細胞之間的異質性(圖 6D)。此外，作者還將糖載體策略應用于50個細胞水平的三種細胞系(HeLa、AC16 和 A549)的差異 N-糖蛋白組分析。如圖 6E 所示，對定量的完整N-糖肽進行主成分分析(PCA)，結果表明細胞按細胞類型分組，三種細胞系之間存在明顯差異，這進一步證明了糖載體策略的定量重現(xiàn)性。重復之間的技術差異低于細胞類型之間的 N - 糖蛋白組模式差異，這表明該策略能夠識別細胞異質性。進一步將樣品量減少到單細胞水平揭示了不同 HeLa 細胞之間的細胞異質性。在無監(jiān)督層次聚類分析中發(fā)現(xiàn)了單個 HeLa 細胞中 N - 糖肽的差異表達(圖 6F)。作為概念驗證，該策略成功區(qū)分了三種不同的細胞系，并利用完整的 N-糖肽譜發(fā)現(xiàn)了小鼠大腦中小膠質細胞(MG)的區(qū)域異質性，表明其在生物和生物醫(yī)學研究中具有廣泛的應用潛力。
圖6 單細胞和微量細胞中完整 N - 糖肽的分析
(A) 從單個、10 個和 50 個 HeLa 細胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的完整 N - 糖肽數(shù)量。(B) 從大量 HeLa 酶解物和單個 HeLa 細胞中累積鑒定出的 N - 糖肽。(C) 強度比較。(D) 從單個、10 個和 50 個 HeLa 細胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的 N - 糖肽的變異系數(shù)(CV)分布(n = 7)。(E) 來自三種細胞系的 N - 糖肽的主成分分析(n = 14)。(F) 單個 HeLa 細胞的 N - 糖肽的無監(jiān)督層次聚類(點擊查看大圖)
綜上所述，基于等壓標記TMT的載體策略，作者使用高場非對稱波形離子遷移譜儀FAIMS聯(lián)用Orbitrap Exploris 480 質譜儀進行非富集單細胞N-糖肽分析。使用從大量細胞樣本中獲得的 N-糖肽作為載體通道，顯著提高了 N-糖肽的 “總” 信號，從而實現(xiàn)了對單個 HeLa 細胞平均260個 N-糖肽的首次定量分析。
總結
由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測方案等因素的存在，在單細胞水平上對翻譯后修飾進行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。隨著單細胞樣品前處理技術以及高端質譜檢測器性能的突飛猛進，在無需特定富集方案的前提下進行翻譯后修飾分析已成為可能?；谳d體蛋白組的SCoPE-MS策略能夠提高整體樣品的蛋白質含量，從而降低對LC-MS系統(tǒng)的靈敏度要求。此外，當前已有最高通量為32 plex的TMT標簽，在不加入載體蛋白質的情況下能夠同時對32個樣本進行相對定量分析，能夠顯著提升單細胞蛋白質(修飾組)的分析通量[3]。相信未來結合數(shù)據(jù)庫單細胞修飾搜索算法的優(yōu)化，基于無損樣品前處理在超高靈敏度質譜系統(tǒng)Orbitrap Astral/Ascend Tribrid的加持下，單細胞修飾的鑒定將會迎來嶄新的局面。
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