抗體的特異性鑒定方法及特異性選擇考慮方面

      抗體（antibody，Ab）是機體在體內(nèi)存在的外來分子、微生物等抗原物質(zhì)刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig），主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中?？贵w特異性鑒定是免疫化學(xué)技術(shù)中，確保抗原-抗體反應(yīng)專一性的基礎(chǔ)。從根本上驗證特異性，投稿國際期刊，常常需要準(zhǔn)備這方面數(shù)據(jù)。

     鑒定抗體的特異性有四種基本方法：分子遺傳法、獨立抗體驗證法、正交法和標(biāo)簽蛋白法。四種方法并非必須同時采用。通常，根據(jù)實驗的目的和研究設(shè)計的特點，選擇對自己的實驗來說具有說服力的1到2種即可。

1、分子遺傳法。

對于遺傳編碼清楚的蛋白質(zhì)，可采用分子遺傳學(xué)技術(shù)（基因敲除模型、CRISPR-Cas9、RNA干擾等）將該蛋白的表達(dá)水平顯著降低，然后用待檢抗體進行標(biāo)記。如果得到陽性減弱或消失的結(jié)果，說明抗體標(biāo)記的正是該蛋白質(zhì)。采用該方法要注意兩個問題。其一，針對基因的敲除或敲減操作不一定能馬上減少相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平。有的蛋白質(zhì)在生物樣本中可能有足量儲備，存在“緩沖池”；必須耗去這部分存量才能觀察到表達(dá)的下降。能否在允許的時間內(nèi)下調(diào)蛋白水平，是一個需要預(yù)試的問題。其二，基因及相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平下調(diào)后，抗體標(biāo)記強度減弱，其實驗證了抗體和該基因產(chǎn)物的“相關(guān)性”，但嚴(yán)格說來，還有可能標(biāo)記的并不是目標(biāo)蛋白質(zhì)。尚存在這樣的可能：抗體標(biāo)記的蛋白質(zhì)是與目標(biāo)蛋白有密切相互作用的另一種蛋白。比如，目標(biāo)蛋白減少后，抗體實際標(biāo)記的蛋白無從錨定（比如膜蛋白），進而在標(biāo)本處理過程中流失，結(jié)果免疫標(biāo)記強度減弱。此時應(yīng)設(shè)計針對性的實驗來補充驗證。

2、獨立抗體驗證法。

同一目標(biāo)分子，可采用針對不同抗原決定簇的抗體來標(biāo)記。當(dāng)需要對某種蛋白分子進行免疫標(biāo)記時，如果手中已有經(jīng)過特異性鑒定合格的其他抗體，且識別的結(jié)構(gòu)位點與待檢抗體不同，那么原有抗體就可作為一個良好的陽性參照。如果待檢抗體與原有的合格抗體具有相同的標(biāo)記結(jié)果，說明待檢抗體的特異性是合格的。本法應(yīng)用時須注意蛋白分子亞型之間的區(qū)別。比如，待檢抗體與原有合格抗體的識別位點在有的亞型二者都存在，而有的亞型則可能缺少其中之一。結(jié)構(gòu)變化可能引起功能和分布的差別，此時本法就不能起到鑒定作用。

3、正交法。

正交法即采用互不影響的技術(shù)對抗體標(biāo)記的是否為目標(biāo)分子進行鑒定的方法。比如要鑒定抗體是否能特異性標(biāo)記某蛋白質(zhì)，可通過質(zhì)譜技術(shù)、色譜分離技術(shù)、針對生成該蛋白的RNA的原位雜交等，與抗體標(biāo)記一道進行平行實驗。如果不同技術(shù)的檢測豐度/強度一致，說明抗體的標(biāo)記具有特異性。采用該法時須注意各種技術(shù)自身的非特異性問題，避免因參照技術(shù)本身的特異性缺陷而減弱鑒定結(jié)果的說服力。

4、標(biāo)簽蛋白法。

可采用FLAG、V5等親和標(biāo)簽或GFP等熒光偶聯(lián)蛋白對待檢抗體進行鑒定。如果抗親和標(biāo)簽的抗體標(biāo)記強度或熒光信號強度與待檢抗體的標(biāo)記強度一致，則說明待檢抗體具有特異性。

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標(biāo)記物的特異性。

1、蛋白特異性

針對需要檢測的蛋白查找抗體，幾個細(xì)節(jié)要區(qū)分：

a.重組蛋白如果不是全長表達(dá)，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，查看交叉反應(yīng)的情況。

c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點，不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在，不宜一概而論。

2、種屬特異性

同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。

a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。

b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過蛋白的序列比對，選擇同源序列免疫的抗體，不過一般這種情況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體選擇。

3、實驗方法特異性

目前使用抗體的實驗方法有很多，不同的使用方法過程中，因為對蛋白樣品的處理方式不一樣，蛋白的含量有差異，對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。

4、標(biāo)記物的特異性

一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標(biāo)記的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達(dá)到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗，可能就會使用到直接標(biāo)記的一抗，比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍，針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實驗中，需要選配不同的熒光標(biāo)記物。