蛋白質免疫印跡法（WB)）實驗問題解答

蛋白質免疫印跡法（Western Blot）它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，基本原理是經(jīng)過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。

Western blot一般流程圖：

蛋白樣品的制備：
1、水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解  度大，是提取蛋白質常用的的溶劑，操作相對麻煩，重復性一般；
2、有機溶劑提取法；
3、離心管柱提取法：超快速，易用，高產(chǎn)及重復性強；
4、通過層析或電洗脫法制備目的蛋白。

Western blot常見問題及注意事項：
1、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長； 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

2、我做的蛋白質分子量很?。?/span>10 KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2 μm的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。

3、最后顯色時用 DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級蛋白，具體可以根據(jù)你實驗的情況。

4、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定 量，但是不能定位。
       ②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

5、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×106就足夠了。

6、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。

7、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

8、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。

9、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？
答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點。

10、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

12、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

13、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？
答：可以。

14、蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE，濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調節(jié)；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15、細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應的蛋白酶抑制劑。

16、 PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯(lián)，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

17 、westernblot內參選擇什么合適？
答：這與目標抗原的表達位置有關，對于胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內參VCDA1/Porin和COXIV；核內抗原可以選擇內參Lamin B1、TBP和histone。

18、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？
答：轉移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率；使用戊er醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉移時間。

19、轉膜時凝膠腫脹或卷曲？
答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min。

20、跑膠的條帶歪斜或者漂移？
答：電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。

21、轉膜后膜上有單個或多個白點？
答：轉膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。

22、轉膜緩沖液過熱？
答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉膜過程中注意降溫。

23、顯影后膠片背景太高？
答：轉膜前PVDF膜沒有用100%甲醇全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數(shù)；封閉不全，選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗?jié)舛冗^高，降低二抗?jié)舛龋灰豢固禺愋圆粡?，換用特異性較強的單克隆抗體；曝光時間過長，減少曝光時間。

24、結果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？
答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時間不夠；轉膜不好，轉膜后可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當，效價降低。

25、目的條帶位置偏低或者偏高？
答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。

26、有非特異性條帶？
答：目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙?；稽c等），本身可以呈現(xiàn)多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結果，可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異性結合；樣品蛋白質可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當?shù)牡鞍酌敢种苿?，避免樣品反復凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的濃度。

27、膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。     二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應位置；二抗失活。

28、目的條帶是白色，周圍有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗?jié)舛绕?，二抗?/span>HRP催化活力太強。