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【微課堂】環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計(jì)數(shù)方法

來源：浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司 2024年08月27日 16:06

《藥品GMP指南》生物指示劑的應(yīng)用中指出，實(shí)驗(yàn)室在接受商品化生物指示劑時，應(yīng)進(jìn)行微生物數(shù)量測定。

那么，環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑的總芽孢數(shù)是如何確定的呢？接下來為大家分享泰林環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑（Bacillus atrophaeus ATCC9372）的芽孢計(jì)數(shù)方法。

環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計(jì)數(shù)—操作方法

隨機(jī)抽取需檢驗(yàn)批次環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑取4片（支）放置于提前照過紫外的生物安全柜中（相關(guān)物品已放置于生物安全柜中），用酒精棉擦拭指示劑外表，通風(fēng)15min以上，后續(xù)操作如下：

注意：生物指示劑不要進(jìn)行紫外照射，可能會造成計(jì)數(shù)結(jié)果偏低?。?！

01 芽孢洗脫

在生物安全柜中，取4片（支）生物指示劑打開，取出載體，分別放置于含有3-4顆玻璃珠（直徑6mm）的無菌試管中，向無菌試管中加入3mL的含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水，置于渦旋混勻儀上充分振蕩，將試管中載體打散成纖維裝后，再中加入7mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水，震蕩30s，制成均一的菌懸液，將該試管記為10^-1。

02 熱激活

將水浴鍋加熱至80℃-85℃，取上述試管，放置于水浴鍋中熱激活10min，熱激完成后，立即將芽孢懸液轉(zhuǎn)移至0-4℃的冰水浴中冷卻至室溫。

03 梯度稀釋

將該試管轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，于旋渦混勻儀上旋渦30s，用移液槍吸取1mL芽孢懸液，加入到另一根含有9mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水的試管中，記為10^-2，按照該方法依次稀釋至10^-3、10^-4（稀釋級別按制造商提供的芽孢數(shù)量而定）。

04 制備計(jì)數(shù)平皿

取芽孢數(shù)在30cfu/mL-300cfu/mL的稀釋級別的試管（10^-4）震蕩30s，每支稀釋管平行制備2個平皿，每皿加1mL菌懸液，注入15mL-20mL溫度不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。等待瓊脂凝固后，倒置于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-72h后計(jì)數(shù)。

05 計(jì)算

總芽孢數(shù)cfu/片（支）=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

06 判定標(biāo)準(zhǔn)

（Bacillus atrophaeusATCC9372）的菌落圓形、凸面、粗糙、不透明，顏色呈淡黃色或淡橘色，菌落生長狀態(tài)良好，單一，無雜菌?？傃挎邤?shù)結(jié)果應(yīng)在產(chǎn)品標(biāo)示值的50%-300%范圍內(nèi)。

注意事項(xiàng)

1、切勿將生物指示劑進(jìn)行紫外照射消毒，建議對初級包裝進(jìn)行擦拭。

2、環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計(jì)數(shù)，建議使用含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水進(jìn)行稀釋。

3、吸取含紙質(zhì)載體的菌液時，避免纖維堵槍頭，導(dǎo)致移液不準(zhǔn)確。

4、建議以單片（支）生物指示劑的形式進(jìn)行計(jì)數(shù)，確保每片（支）生物指示劑計(jì)數(shù)結(jié)果均符合要求。

5、建議使用玻璃珠（4mm-6mm）對紙質(zhì)載體進(jìn)行打散處理。

6、芽孢計(jì)數(shù)過程中必須進(jìn)行熱激活處理：溫度80℃-85℃，時間10min。

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