染料法和探針法熒光定量PCR（RT-qPCR）的優(yōu)缺點(diǎn)比較

其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入過量熒光染料，DNA擴(kuò)增的過程中，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且可以實(shí)時(shí)測(cè)量。如果你要擴(kuò)增你的目標(biāo)樣品40個(gè)循環(huán)，在最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)到的熒光會(huì)比在第10個(gè)循環(huán)測(cè)得的熒光強(qiáng)很多。

優(yōu)點(diǎn)：

1、成本較低，適合大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。

2、在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段非常省時(shí)，因?yàn)樗恍枰线m的引物設(shè)計(jì)。

缺點(diǎn)：

1、特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產(chǎn)物。

2、如果引物二聚體存在或者產(chǎn)物受到污染，得到的結(jié)果會(huì)不可靠。3、更容易與低豐度的目標(biāo)產(chǎn)生非特異性熒光。

需要更多的時(shí)間進(jìn)行結(jié)果分析。

這種方法涉及使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸(短DNA分子)，探針通常在5 '端和3 '端都被標(biāo)記。

在探針的5’端有報(bào)告基團(tuán)，3’端設(shè)計(jì)淬滅基團(tuán)，當(dāng)報(bào)告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)時(shí)，不會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。RT-qPCR反應(yīng)時(shí)，寡核苷酸兩個(gè)基團(tuán)分離，即可檢測(cè)到熒光信號(hào)，并與PCR產(chǎn)物同步。

使用這種方法的熒光檢測(cè)依賴于兩個(gè)過程:1)引物與目標(biāo)序列的結(jié)合(2)探針與引物下游

互補(bǔ)序列的結(jié)合。

優(yōu)點(diǎn)：

1、更有可能只放大所需的產(chǎn)物，由于引物和探針的結(jié)合具有特異性。

2、不需要解離曲線，只有探針與正確的目的序列結(jié)合時(shí)才能檢測(cè)到熒光。

3、由于具有特異性，數(shù)據(jù)更可靠。

4、數(shù)據(jù)分析時(shí)節(jié)省時(shí)間。

缺點(diǎn)：

1、需要大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)耗費(fèi)成本高。

2、需要更長(zhǎng)的時(shí)間來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樾枰玫囊锖吞结槨?/p>