2022《保健食品功能評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)試驗(yàn)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)解讀

標(biāo)準(zhǔn)背景

2022年4月15日，由中國(guó)保健協(xié)會(huì)管理歸口，杭州環(huán)特生物科技股份有限公司牽頭，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所等22家企業(yè)、科研院所共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)——《保健食品功能評(píng)價(jià) 斑馬魚(yú)試驗(yàn)規(guī)程》（T/CHC2003-2022）正式發(fā)布并實(shí)施。

為了使大家更好地了解《保健食品功能評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)試驗(yàn)規(guī)程》這一團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)內(nèi)容，幫助更多的保健食品企業(yè)在研發(fā)中更好地應(yīng)用斑馬魚(yú)技術(shù)開(kāi)展斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)，從而適應(yīng)保健食品行業(yè)消費(fèi)者需求變化快、產(chǎn)品研發(fā)周期短的發(fā)展趨勢(shì)，環(huán)特生物推出“團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)解讀”系列，供大家參考。第一期《標(biāo)準(zhǔn)解讀（一） | 《保健食品功能評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)試驗(yàn)規(guī)程》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)解讀！》（點(diǎn)擊可回顧）已推出。

今天，我們將為大家送上第二期，快一起來(lái)看吧↓↓

主要內(nèi)容及解讀

正式試驗(yàn)內(nèi)容及解讀

1. 試驗(yàn)分組

標(biāo)準(zhǔn)原文：

正式試驗(yàn)按照以下方法挑選斑馬魚(yú)置于微孔板中進(jìn)行分組：

a) 正常對(duì)照組：含斑馬魚(yú)及標(biāo)準(zhǔn)稀釋水；

b) 模型對(duì)照組：含有模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚(yú)；

c) 陽(yáng)性對(duì)照組：含有陽(yáng)性對(duì)照樣品、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚(yú)。每次試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組即可；

d) 受試樣品測(cè)試組：含有受試樣品、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚(yú)。將受試樣品儲(chǔ)備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以幾何級(jí)數(shù)稀釋成一組適宜的濃度系列，備用。宜設(shè)置3～5個(gè)濃度組，以幾何級(jí)數(shù)濃度系列設(shè)置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數(shù)≤3.2，宜設(shè)為2；

e) 溶劑對(duì)照組：含有助溶劑、模型誘導(dǎo)劑和斑馬魚(yú)。當(dāng)受試樣品配制過(guò)程中使用了助溶劑，應(yīng)設(shè)置該組，助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V）。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

正式試驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、受試樣品測(cè)試組（宜設(shè)置3～5個(gè)濃度組，以幾何級(jí)數(shù)濃度系列設(shè)置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數(shù)≤3.2，宜設(shè)為2）、溶劑對(duì)照組（當(dāng)受試樣品配制過(guò)程中使用了助溶劑，應(yīng)設(shè)置該組，助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度不大于1%（W/V或V/V））。

對(duì)于助溶劑的使用*，根據(jù)長(zhǎng)期積累的數(shù)據(jù)以及本標(biāo)準(zhǔn)涉及到實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的特點(diǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)將助溶劑的濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%。在實(shí)驗(yàn)溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應(yīng)超過(guò)0.1%。只有當(dāng)受試樣品溶解性確實(shí)不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度增加到1%。

2. 造模

標(biāo)準(zhǔn)原文：

選擇受精后一定天數(shù)的斑馬魚(yú)，用誘導(dǎo)劑處理一段時(shí)間，建立斑馬魚(yú)保健食品功能評(píng)價(jià)模型。根據(jù)保健食品功能選擇合適的斑馬魚(yú)模型。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

不同保健食品功能選擇的斑馬魚(yú)模型不同，造模方式也不一樣。選擇受精后一定天數(shù)的一定品系的斑馬魚(yú)，用誘導(dǎo)劑處理一定的時(shí)間，建立斑馬魚(yú)保健食品功能評(píng)價(jià)模型。根據(jù)保健食品功能選擇合適的斑馬魚(yú)模型，不同斑馬魚(yú)模型的建立方法。

3. 受試樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)原文：

根據(jù)試驗(yàn)需求，預(yù)先篩選好足夠數(shù)量且發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎，并隨機(jī)分配到試驗(yàn)容器中，每孔斑馬魚(yú)數(shù)量至少為10尾。用模型誘導(dǎo)劑建立斑馬魚(yú)模型，然后向試驗(yàn)容器中加入一定體積的受試樣品溶液（飼養(yǎng)密度宜為1尾/100μL）、陽(yáng)性對(duì)照樣品。充分混勻后，用鋁箔紙包裹，在28℃生化培養(yǎng)箱中避光孵育至終點(diǎn)。

4. 死亡與毒性判斷

標(biāo)準(zhǔn)原文：

當(dāng)所有試驗(yàn)組斑馬魚(yú)死亡率≤10%時(shí)，準(zhǔn)許進(jìn)入數(shù)據(jù)采集階段。

5. 數(shù)據(jù)采集

標(biāo)準(zhǔn)原文：

應(yīng)根據(jù)不同斑馬魚(yú)保健食品功能評(píng)價(jià)模型的具體評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇合適的數(shù)據(jù)采集方式，數(shù)據(jù)采集具體方式如下：

a) 直接拍照：孵育結(jié)束后，從表型正常的斑馬魚(yú)中隨機(jī)選取至少10尾斑馬魚(yú)，用三卡因麻醉后，將斑馬魚(yú)用3%甲基纖維素固定（甲基纖維素應(yīng)提前在室溫放置至少30分鐘），在體視顯微鏡或熒光顯微鏡（轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)品系相關(guān)的試驗(yàn)）下觀察、拍照并保存。所有試驗(yàn)組斑馬魚(yú)拍照應(yīng)在相同的儀器和環(huán)境條件下完成，且斑馬魚(yú)體位保持一致。利用圖像處理軟件測(cè)量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

b) 染色后拍照：孵育結(jié)束后，試驗(yàn)容器中的斑馬魚(yú)用養(yǎng)殖水清洗3次，采用特異性熒光染料或組織化學(xué)染料對(duì)各組斑馬魚(yú)進(jìn)行染色。染色后各組至少取10 尾斑馬魚(yú)，用3%甲基纖維素固定。特異性熒光染料染色的斑馬魚(yú)用熒光顯微鏡觀察、拍照并保存，組織化學(xué)染料染色的斑馬魚(yú)用體視顯微鏡觀察、拍照并保存。利用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

c) 運(yùn)動(dòng)行為分析：孵育結(jié)束后，試驗(yàn)容器中的斑馬魚(yú)用養(yǎng)殖水清洗3次，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選擇斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔1尾，利用行為分析儀記錄斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡，記錄時(shí)間宜為20 min～1 h，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

d)酶標(biāo)儀檢測(cè)：孵育結(jié)束后，試驗(yàn)容器中的斑馬魚(yú)用養(yǎng)殖水清洗3次，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選擇斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔1～3尾，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值、熒光值或生物光值。選擇符合檢測(cè)試劑要求的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)間宜為20 min～1 h，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于3個(gè)。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

應(yīng)根據(jù)不同斑馬魚(yú)功能評(píng)價(jià)模型的具體評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇合適的數(shù)據(jù)采集方式，數(shù)據(jù)采集具體方式如下：

a）直接拍照：斑馬魚(yú)的膽囊在斑馬魚(yú)軀干偏右側(cè)，當(dāng)斑馬魚(yú)側(cè)躺時(shí)，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會(huì)對(duì)拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚(yú)的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點(diǎn)瓊脂糖或甲基纖維素等對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行固定。斑馬魚(yú)從開(kāi)始麻醉到拍照結(jié)束的時(shí)間不宜超過(guò)30分鐘，超過(guò)30分鐘可能會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)造成損傷或?qū)е滤劳?。利用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），為了保證后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

b）染色后拍照：拍照時(shí)一般要求斑馬魚(yú)應(yīng)頭朝左、腹部朝下、*側(cè)躺，所有斑馬魚(yú)的體位保持一致。斑馬魚(yú)的膽囊在斑馬魚(yú)軀干偏右側(cè)，當(dāng)斑馬魚(yú)側(cè)躺時(shí)，如果背朝上、頭向右的話，膽囊可能會(huì)對(duì)拍照造成干擾。為了保證所有斑馬魚(yú)的體位盡量固定并保持一致，建議用低熔點(diǎn)瓊脂糖或甲基纖維素等對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行固定。熒光顯微鏡拍照時(shí)，相機(jī)的相關(guān)參數(shù)設(shè)置應(yīng)既能保證拍到熒光信號(hào)、又能很大程度減少背景噪點(diǎn)，盡量減少背景干擾。整個(gè)熒光顯微鏡拍照過(guò)程中要盡量減少可見(jiàn)光照射或照射強(qiáng)度，以免熒光試劑猝滅過(guò)快，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。斑馬魚(yú)從開(kāi)始麻醉到拍照結(jié)束的時(shí)間不宜超過(guò)30分鐘，超過(guò)30分鐘可能會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)造成損傷或?qū)е滤劳觥＠脠D像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)量累積光密度（體視顯微鏡）或熒光強(qiáng)度（熒光顯微鏡），為了保證后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

c）運(yùn)動(dòng)行為分析：正式記錄前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行預(yù)跑10 min，以檢測(cè)及維持儀器穩(wěn)定并可使斑馬魚(yú)更好的適應(yīng)環(huán)境，記錄時(shí)間宜為20 min-1 h，為了保證后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的有效性，每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個(gè)。

結(jié)果評(píng)價(jià)及解讀

1. 統(tǒng)計(jì)分析

標(biāo)準(zhǔn)原文：

1.1　利用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)圖表制作與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算各組試驗(yàn)的平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（Standard Error，SE），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用Mean ± SE表示。宜采用方差分析，按方差分析的程序進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P值）和方差齊性檢驗(yàn)（F值）。

1.2　當(dāng)F<0.05，P<0.05時(shí)，各組均數(shù)間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

1.3　當(dāng)F≥0.05，P≥0.05時(shí)，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4　對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2. 結(jié)果有效性分析

標(biāo)準(zhǔn)原文：

2.1　正常對(duì)照組（當(dāng)使用了助溶劑，也包括溶劑對(duì)照組）斑馬魚(yú)的死亡率或異常率不得超過(guò)10%，超過(guò)10%則該次試驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。

2.2　模型對(duì)照組與正常對(duì)照組之間的原始數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，陽(yáng)性對(duì)照組與模型對(duì)照組之間的原始數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。

2.3　當(dāng)使用了助溶劑，溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組之間的原始數(shù)據(jù)不能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

根據(jù)前期積累的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及本次用已上市保健食品和在研保健食品開(kāi)展的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)且僅當(dāng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)滿足如下的質(zhì)量控制要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性才會(huì)被認(rèn)可。只準(zhǔn)許有效試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)入試驗(yàn)報(bào)告撰寫(xiě)/審核階段。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫(xiě)及解讀

標(biāo)準(zhǔn)原文：

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

a) 檢測(cè)依據(jù)；

b) 受試樣品和陽(yáng)性對(duì)照的信息，包括與試驗(yàn)操作相關(guān)的理化性狀；

c) 斑馬魚(yú)來(lái)源和品系等相關(guān)信息；

d) 試驗(yàn)條件和方法，包括試驗(yàn)具體步驟；

e) 試驗(yàn)開(kāi)始至完成的日期；

f) 試驗(yàn)結(jié)果，包括測(cè)定數(shù)據(jù)、計(jì)算值、圖像數(shù)據(jù)等；

g) 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法；

h) 結(jié)論。

標(biāo)準(zhǔn)解讀：

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括：檢測(cè)依據(jù)、受試樣品和陽(yáng)性對(duì)照的信息、斑馬魚(yú)來(lái)源和品系等相關(guān)信息、試驗(yàn)條件和方法、試驗(yàn)開(kāi)始至完成的日期、試驗(yàn)結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法、結(jié)論。

實(shí)施意義

該標(biāo)準(zhǔn)是環(huán)特生物攜手國(guó)內(nèi)22家科研院所、企業(yè)發(fā)布的用于食品保健功能檢測(cè)的完整斑馬魚(yú)技術(shù)規(guī)程，不僅補(bǔ)上了我國(guó)食品保健功能檢測(cè)領(lǐng)域斑馬魚(yú)技術(shù)規(guī)程團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的空白，從檢測(cè)依據(jù)、斑馬魚(yú)來(lái)源和品系等信息、試驗(yàn)條件和方法、試驗(yàn)結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法、推薦參數(shù)等關(guān)鍵技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行了充分的實(shí)驗(yàn)規(guī)范規(guī)定及技術(shù)創(chuàng)新，其結(jié)果適用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能評(píng)價(jià)。

而且，該標(biāo)準(zhǔn)將進(jìn)一步助力我國(guó)斑馬魚(yú)技術(shù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)體系的完善，全面提升我國(guó)斑馬魚(yú)技術(shù)在保健食品行業(yè)功能評(píng)價(jià)方面的標(biāo)準(zhǔn)化及應(yīng)用化水平等，對(duì)行業(yè)具有重要的指導(dǎo)性意義與推動(dòng)性作用。