犬巴貝斯蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

使用方法:
一、樣品 DNA 的制備
用自選方法提取 Cps DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備 Cps 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽(yáng)性對(duì)照，只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的 DN**段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到10E7 拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。
4. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 Cps 陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。
5. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。
6. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。
7. NC 管中不加任何陽(yáng)性對(duì)照。
8. 從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見(jiàn)下步），每個(gè)樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門(mén)的區(qū)域操作。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
(3) 簡(jiǎn)便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。
(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。
注意事項(xiàng)：
①加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
④底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
⑤洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
⑦實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
⑧試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
以下是犬巴貝斯蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的相關(guān)產(chǎn)品：

間 英文名稱：Two trimethoprim 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

二甲氧芐啶 英文名稱：Magnesium valproate 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

丙鎂 英文名稱：4- hydroxy benzene between two formic acid 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

4-羥基間二 英文名稱：4- hydroxy benzoic acid 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

4-羥基苯 英文名稱：Six fluorine isopropanol 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

六氟 英文名稱：Seven halothane 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

* 英文名稱：N- methyl Pa Rossi Dean 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

N-甲基* 英文名稱：To fluoride paroxetine 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

去氟* 英文名稱：Trans Pa Rossi Dean 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

反式* 英文名稱：Homatropine hydrobromide 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

后馬托品 英文名稱：5- nitro furfural two acetate 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

5-硝基二酯 英文名稱：10- methoxy -4- (1- methyl piperidine based -4- 規(guī)格：：100mg 保存：：-20℃，避光

10-甲氧基-4-（1-甲基-4-基 英文名稱：Clioquinol system suitability test control products 規(guī)格：：50mg 保存：：-20℃，避光

羥喹系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對(duì)照品 英文名稱：Clofazimine 規(guī)格：：20mg 保存：：-20℃，避光

犬巴貝斯蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)兔抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)ELISA Kit  Rabbit Anti-endothelial cell antibodies,AECA ELISA Kit

牛生長(zhǎng)激素釋放多肽(GHRP)ELISA Kit  Bovine Growth Hormone Releasing Peptide,GHRP ELISA Kit

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