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專注細(xì)胞治療，打造全流程解決方案

閱讀：565 發(fā)布時(shí)間：2023/4/24

　　細(xì)胞治療作為一種先進(jìn)療法，已是藥企研發(fā)熱門領(lǐng)域，也是投資熱點(diǎn)。隨著國內(nèi)外細(xì)胞治療產(chǎn)品陸續(xù)獲批上市，細(xì)胞治療步入高速發(fā)展期。從全球細(xì)胞治療管線來看，在不同細(xì)胞治療類別中，CAR-T細(xì)胞治療仍是管線最多的種類，其2022年CAR-T在研管線，同比增長24%，基于NK的細(xì)胞治療數(shù)量同比增長55%，除此之外的其他細(xì)胞治療，如干細(xì)胞治療、DC免疫細(xì)胞療法等，2022年增長為129% (見下圖)。

(圖片來源：Nat Rev Drug Discov. 2022 Sep;21(9):631-632)

　　作為細(xì)胞治療產(chǎn)品步入商業(yè)化時(shí)代關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細(xì)胞治療產(chǎn)品制備工藝相較其他藥物更為復(fù)雜。下文以細(xì)胞治療藥物制備常用載體慢病毒載體生產(chǎn)工藝、CAR-T制備工藝、干細(xì)胞(例如iPSC與MSC)制備工藝為例，淺析細(xì)胞治療工藝面臨的挑戰(zhàn)及其解決方案。

慢病毒載體生產(chǎn)工藝要點(diǎn)

　　1.質(zhì)粒制備

　　質(zhì)粒是生產(chǎn)慢病毒載體的起始材料，通常在重組大腸桿菌發(fā)酵過程中獲取。與科研實(shí)驗(yàn)不同，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要更加關(guān)注關(guān)鍵的工藝步驟，例如：細(xì)菌發(fā)酵中的供氧效率、堿裂解參數(shù)、質(zhì)粒經(jīng)過純化后的HCP，HCD，內(nèi)毒素含量與超螺旋比例等，這將直接影響到最終質(zhì)粒的產(chǎn)量與質(zhì)量。

CIM®整體柱

　　2.細(xì)胞擴(kuò)增

　　現(xiàn)如今被廣泛使用的HEK293細(xì)胞貼壁培養(yǎng)技術(shù)，目前因慢病毒的產(chǎn)能不足，貼壁工藝應(yīng)用到慢病毒載體大規(guī)模制備的話，仍不能很好的解決這個(gè)問題。此外，貼壁培養(yǎng)中添加的血清，需要在后續(xù)純化過程中去除。而懸浮無血清細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使得慢病毒載體生產(chǎn)的工藝放大更為容易，可通過提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度，提高慢病毒的產(chǎn)量，由于沒有血清的添加也為慢病毒下游純化減少了負(fù)擔(dān)。

Ambr® 15細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

　　3.轉(zhuǎn)染與病毒擴(kuò)增

　　目前有多種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，但都有各自的局限性。例如，利用磷酸鈣進(jìn)行的轉(zhuǎn)染，其試劑純度和pH敏感性會(huì)導(dǎo)致病毒載體生產(chǎn)在批次間存在顯著差異，對于包裝慢病毒的細(xì)胞有毒性，且轉(zhuǎn)染效率低。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率相對較高且細(xì)胞毒性較低，但試劑費(fèi)用較貴。目前病毒載體規(guī)?；a(chǎn)中使用廣泛的轉(zhuǎn)染試劑是聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)，其主要的優(yōu)勢是提高了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基與生物反應(yīng)器對于提高病毒產(chǎn)量同樣也有著重要的影響。


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　　4.收獲及澄清

　　一般在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)內(nèi)，對慢病毒載體進(jìn)行收獲。澄清為的是從含有慢病毒的原始料液中去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。該步驟通常包括深層/深度過濾、切向流微濾、低速離心，或這些操作的組合。由于慢病毒載體的存在包膜結(jié)構(gòu)，對剪切力敏感，且慢病毒載體的理化性質(zhì)不穩(wěn)定，對溫度及pH等也敏感，因此澄清手段要溫和，避免慢澄清過程中操作造成病毒的破碎與失活。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，還需要考慮設(shè)備使用前后的清潔消毒，因此使用一次性技術(shù)，可大大降低時(shí)間成本的投入，提高生產(chǎn)效率。

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　　5.載體的純化

　　在澄清之后，慢病毒載體的純化通常使用陰離子交換層析和/或切向流過濾(TFF)，慢病毒載體的純化是慢病毒載體生產(chǎn)工藝的最大挑戰(zhàn)。如上所述，慢病毒載體對剪切力敏感、理化性質(zhì)不穩(wěn)定，因此，下游工藝中的回收率通常較低，需要關(guān)注層析與超濾工藝的優(yōu)化，確保收率的提升。


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　　6.終端除菌及灌裝

　　經(jīng)過澄清與純化后，獲得慢病毒載體的原液，需要經(jīng)過終端除菌降低微量微生物污染的威脅。除菌過濾后的灌裝過程中需要嚴(yán)格按照法規(guī)對于無菌灌裝的要求操作，以保證最終產(chǎn)品的無菌性、無熱原、無可見異物、無可溶性微粒等。

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CAR-T制備工藝要點(diǎn)

　　1.將T細(xì)胞從患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中分離出來

　　CAR-T細(xì)胞的制備是以人作為供體進(jìn)行細(xì)胞的采集，血液中的PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)是制備CAR-T產(chǎn)品的起始細(xì)胞材料。CAR-T產(chǎn)品制備的起始細(xì)胞原料的檢測表征和質(zhì)量質(zhì)控(例如：檢測支原體等污染物的檢測、不同細(xì)胞類群占比的表征等)，對于最終CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性及產(chǎn)品療效，質(zhì)量等都至關(guān)重要。特別強(qiáng)調(diào)的是因?yàn)榧?xì)胞治療產(chǎn)品的特殊性對于微生物檢測結(jié)果的速度要求更快一些。


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　　2.T細(xì)胞的篩選富集和激活

　　由于PBMC中的其他細(xì)胞對后續(xù)T細(xì)胞的擴(kuò)增、激活或轉(zhuǎn)導(dǎo)造成干擾，因此需要進(jìn)一步篩選富集T細(xì)胞。T細(xì)胞分選富集后，需要對其刺激促進(jìn)T細(xì)胞激活，從而獲得足夠活化的T細(xì)胞，用于后續(xù)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，制備CAR-T細(xì)胞。


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　　3.對激活的T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾與CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增

　　CAR-T工藝中多采用慢病毒進(jìn)行目的基因的遞送。為了要達(dá)到臨床治療所需要的細(xì)胞數(shù)量，大規(guī)模制備過程中，可在一次性生物反應(yīng)器中進(jìn)行CAR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及T細(xì)胞的擴(kuò)增。其中細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間、生物反應(yīng)器的選擇等因素會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增質(zhì)量，過程中也需要檢測，確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。

T細(xì)胞培養(yǎng)基


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　　4.CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)檢，分裝，冷藏或凍存

　　CAR-T產(chǎn)品的質(zhì)控檢測一般包括：細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率、細(xì)胞表型、CAR 陽性率檢測、生物學(xué)效力檢測，無菌檢查、支原體、熱原/內(nèi)毒素的檢測、CAR-T 細(xì)胞基因組中病毒載體拷貝數(shù)及整合的檢測、RCR/RCL檢測、工藝殘留物檢測(如具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的磁珠殘留、細(xì)胞因子殘留、Retronectin殘留等)及腫瘤細(xì)胞殘留檢測等。原則上應(yīng)盡可能用最終CAR-T產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測。

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　　此外，目前細(xì)胞治療藥物工藝中的很多步驟都已逐步實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化及封閉式操作，但就工藝中的培養(yǎng)基、緩沖液等工藝液體分裝而言，大多數(shù)細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)或研發(fā)機(jī)構(gòu)還在采用傳統(tǒng)的人工分裝方式，由于這種方式操作繁瑣，且很多步驟都涉及到了開放式操作，耗時(shí)費(fèi)力且易造成產(chǎn)品的污染，因此，工藝液體分裝的自動(dòng)化和封閉化很有必要。

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iPSC & MSC制備工藝要點(diǎn)

　　1.細(xì)胞的采集與分離

　　細(xì)胞的采集要符合倫理要求，明確其來源，并對細(xì)胞做好質(zhì)控。經(jīng)過采集分離后的細(xì)胞，可進(jìn)行高通量單細(xì)胞挑選，并進(jìn)行單克隆成像驗(yàn)證，確保后續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞的單克隆源性。

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　　2.細(xì)胞的擴(kuò)培

　　為了獲得足夠的治療劑量，需要對干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)培。干細(xì)胞擴(kuò)培過程對于培養(yǎng)基及其添加物的要求較高，培養(yǎng)基及其添加物應(yīng)有足夠的純度并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，隨著代次的增加，易老化。為支撐干細(xì)胞較長期的培養(yǎng)，需對培養(yǎng)基的配方進(jìn)行優(yōu)化。此外，傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)或2D培養(yǎng)方式存在生產(chǎn)數(shù)量有限、人工成本高且無法有效實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)質(zhì)量等缺點(diǎn)。因此，采用自動(dòng)化生物反應(yīng)器結(jié)合微載體培養(yǎng)技術(shù)也許是一種較佳的選擇。

細(xì)胞培養(yǎng)基


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　　3.細(xì)胞收獲與質(zhì)檢

　　擴(kuò)增后的細(xì)胞可通過離心方式進(jìn)行收獲，收獲后需要檢測細(xì)胞的細(xì)胞活力、生物學(xué)功能、致瘤性、微生物、內(nèi)毒素含量等，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量，其中細(xì)胞活力、生物學(xué)功能對于產(chǎn)品的臨床療效至關(guān)重要，而致瘤性、包括支原體檢測在內(nèi)的微生物檢測和內(nèi)毒素檢測等則和干細(xì)胞產(chǎn)品的安全性高度相關(guān)。

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　　4.分裝與保存

　　分裝過程中，易造成細(xì)胞的污染，因此需要嚴(yán)格控制分裝環(huán)境。細(xì)胞凍存液的使用及細(xì)胞儲(chǔ)存條件要嚴(yán)格按照規(guī)范操作，以保證干細(xì)胞制劑穩(wěn)定性及有效期。

　　賽多利斯作為一家為生命科學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域提供創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品和服務(wù)以及生物制藥設(shè)備和一次性解決方案的公司，致力于幫助客戶進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室研發(fā)及生物制藥生產(chǎn)效率。專注于細(xì)胞治療領(lǐng)域，依靠多年深耕生物制品工藝的專業(yè)經(jīng)驗(yàn)，可提端到端，一站式，多維度的全流程產(chǎn)品與服務(wù)。