上海博麥德生物技術(shù)有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品: 培養(yǎng)基,生物培養(yǎng)基 |
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主營(yíng)產(chǎn)品: 培養(yǎng)基,生物培養(yǎng)基 |
2012-9-30 閱讀(1356)
提 供 商 | 上海博麥德生物技術(shù)有限公司 | 資料大小 | 83.6KB |
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免疫熒光抗體法檢查細(xì)胞表面抗原
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
了解特異性免疫熒光抗體反應(yīng)的一般過(guò)程及其在細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用。
【實(shí)驗(yàn)用品】
一、材料和標(biāo)本 人體結(jié)腸癌培養(yǎng)細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、小鼠抗人結(jié)腸癌細(xì)胞抗體(*抗
體)、熒光標(biāo)記羊抗鼠抗體(第二抗體)。
二、器材和儀器 蓋片、載片、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、吸管、普通倒置顯微
鏡,熒光顯微鏡、微量加樣器。
三、試劑 1640 培養(yǎng)液(加 lO%小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液
體石蠟。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
一、原理和意義
用人結(jié)腸癌細(xì)胞為免疫原,免疫小鼠,制得鼠抗人結(jié)腸癌細(xì)胞表面抗原(Ag)的單克隆
抗體 IgG(*抗體),二者可以發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng),形成抗原抗體復(fù)合物,再加
入市售(也可自制)的熒光標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 抗體(第二抗體),可以與復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)生抗
原抗體反應(yīng)(二次抗體反應(yīng)),這樣就可以在熒光顯微鏡下觀察到這種抗原在結(jié)腸癌細(xì)胞表
面的存在(圖 19—1)。
圖 19 一 l 特異性一次、二次抗原抗體反應(yīng)過(guò)程
二、方法
1.將培養(yǎng)瓶中的結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裝有蓋片的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng) 2~3 天。
2.在倒置鏡下觀察到蓋片上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后,在蓋片左上角用玻璃筆做一下標(biāo)
記,以免在以后的操作中正反面顛倒。
3.將蓋片放在甲醛固定液中,4℃固定 5~10 分鐘。
4.用 PBS 洗三次,注意不要將 PBS 液直接倒在蓋片的細(xì)胞面,以免引起細(xì)胞大量丟失。
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用濾紙片將蓋片上的 PBS 輕輕吸干,不要損傷細(xì)胞層。
5.將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上.每個(gè)蓋片 50μl,37℃溫育 30 分鐘。
6.用 PBS 洗三次,濾紙吸干。
7.將已稀釋好的熒光標(biāo)記羊抗鼠二次抗體 5μl 滴加在蓋片上,37℃溫育 30 分鐘。
8.用 PBS 洗三次,濾紙吸干。
9.將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細(xì)胞面朝下放到載玻片上,在熒光顯微鏡下
觀察。
三、結(jié)果
細(xì)胞多成團(tuán)塊狀存在,細(xì)胞膜表面顯示黃綠色熒光,細(xì)胞內(nèi)及背景均不發(fā)光。每組應(yīng)
設(shè)立一個(gè)陰性對(duì)照組,以培養(yǎng)的 HeLa 細(xì)胞為抗原,操作步驟相同。