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單細(xì)胞凝膠電泳的操作步驟

2012-11-30　　閱讀(357)

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【詳細(xì)說(shuō)明】　　單細(xì)胞凝膠電泳的操作步驟
　　
　　1、分離制備單細(xì)胞懸液
　　
　?。?）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液。
　　
　?。?）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物，取出臟器，于Hank’s液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
　　
　　2、膠板制備
　　
　?。?）取20~50μl于56℃水浴中保溫的0.5%普通熔點(diǎn)瓊脂糖，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。
　　
　?。?）取100~150μl0.5%普通熔點(diǎn)瓊脂糖加在底膠上，再于其上加蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
　　
　?。?）取下蓋片，取50~100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與50~100μl細(xì)胞懸液（105個(gè)細(xì)胞/ml）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
　　
　?。?）去掉蓋玻片，取70~100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪片，加蓋玻片，4℃冷凝。
　　
　　3、細(xì)胞裂解與電泳
　　
　?。?）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，4℃裂解1小時(shí)。
　　
　　（2）取出膠板，放入電泳槽中，浸泡在電泳液中解旋20分鐘。
　　
　　（3）4℃電泳20分鐘（25V，300mA）。
　　
　　4、中和與染色：
　　
　　（1）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次15分鐘，共中和兩次，注意更換中和液。
　　
　?。?）取出膠板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗處染色20分鐘。
　　
　?。?）蒸餾水脫色15分鐘。
　　
　　5、鏡檢和分析：
　　
　?。?）在熒光顯微鏡下觀察，綠光激發(fā)吸收濾片590nm，必要時(shí)照相記錄。
　　
　?。?）記數(shù)觀察的細(xì)胞，記錄彗星細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，用目鏡測(cè)微尺測(cè)頭長(zhǎng)與全長(zhǎng)，計(jì)算核DNA遷移距離。


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