摘要
目的: 篩選復(fù)方五味子素組方*配比, 比較
復(fù)方五味子素B及其成分對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖
抑制作用.
方法: 采用L4(23)正交設(shè)計(jì)的方法篩選藥物的
*配比. 用MTT的方法觀察組方及其成分對(duì)
胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用. 空白對(duì)照組加培養(yǎng)
液; 陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組分別加DMSO和5-
氟尿嘧啶(5-FU).
結(jié)果: 高濃度五味子乙素(100 mg/L)、低濃度
蘆薈大黃素(50 mg/L)、低濃度黃芪多糖(50
mg/L)組方為復(fù)方五味子素B的藥物*配比.
同陰性對(duì)照組(0.427±0.018)相比, 五味子
乙素低濃度(0.296±0.011)和高濃度組(0.260
±0.012)、蘆薈大黃素低濃度(0.376±0.017)
和高濃度組(0.334±0.013), 復(fù)方五味素B組
(0.162±0.007)在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度A 值
均顯著性降低(P <0.01); 增殖抑制率結(jié)果顯示,
五味子乙素低濃度(26.26%±4.65%)和高濃
度組(39.11%±5.13%), 蘆薈大黃素高濃度組
(21.78%±3.67%), 復(fù)方五味素B組(52.06%±
9.87%)抑制率均明顯增高.
結(jié)論: 合理的中藥有效成分組方可能有效提
高單純中藥有效成分的作用, 將中藥有效成分
合理組方可能是開發(fā)現(xiàn)代化復(fù)方中藥的有效
方法和途徑之一.
關(guān)鍵詞: 五味子乙素; 蘆薈大黃素; 黃芪多糖; MTT
法; 胃癌
1 材料和方法
1.1 材料 五味子乙素、蘆薈大黃素(中國(guó)藥品
生物制品檢定所); 黃芪多糖(惠州東方植物保
健中心); MTT、胰蛋白酶、胎牛血清、DMSO
(Sigma公司)、RPMI1640(Gibco公司); 人胃癌細(xì)
胞株SGC-7901購(gòu)自上海生命*細(xì)胞化學(xué)與
細(xì)胞生物學(xué)研究所; 培養(yǎng)液為含100 mL/L小牛
血清、青霉素105 U/L、鏈霉素105 U/L的RPMI
1640; 細(xì)胞株在37℃, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培
養(yǎng), 每1-2天更換培養(yǎng)液1次.
1.2 方法
1.2.1 正交設(shè)計(jì)方法篩選藥物*配比 采用L4
(23)正交設(shè)計(jì)表[4], 即三因素(五味子乙素、蘆薈
大黃素、黃芪多糖), 二水平(高濃度100 mg/L,
低濃度50 mg/L), 進(jìn)行三成分*配比篩選. L4
(23)正交設(shè)計(jì)表分組見表1.
1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率 空白對(duì)照組加培
養(yǎng)液; 陰性對(duì)照組加DMSO(終濃度2 g/L); 陽(yáng)性
對(duì)照組加5-氟尿嘧啶(5-FU)(終濃度50 mg/L); 五
味子乙素低濃度組(終濃度50 mg/L); 五味子素
高濃度組(終濃度100 mg/L); 蘆薈大黃素低濃度
組(終濃度50 mg/L); 蘆薈大黃素高濃度組(終濃
度100 mg/L); 黃芪多糖低濃度組(終濃度50 mg/
L); 黃芪多糖高濃度組(終濃度200 mg/L). 每組
設(shè)6個(gè)復(fù)孔, 重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次. 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌
細(xì)胞, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化1-2 min后, 磷酸緩
沖液洗3次, 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×108個(gè)/L接種于96
孔培養(yǎng)板, 每孔100 μL, 24 h后更換培養(yǎng)液加藥,
分組見上, 每組6個(gè)復(fù)孔, 于24 h后, 每孔分別加
入5 g/L的MTT 20 μL, 37℃孵育4 h, 棄上清, 加
入150 μL的DMSO, 在平板搖床微振蕩10 min后,
用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)每孔吸光度(A ), 根
據(jù)A 值判定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響. 抑制率(IR)
= [1-(藥物組平均吸光度值/空白平均對(duì)照組吸
光度值)]×100%.
2 結(jié)果
2.1 正交設(shè)計(jì)方法篩選藥物*配比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
五味子乙素的1(高濃度)水平之和為263.72, 2(低
濃度)水平之和為251.72; 蘆薈大黃素的1(高濃
度)水平之和為254.64, 2(低濃度)水平之和為
260.80; 黃芪多糖的1(高濃度)水平之和為256.68,
2(低濃度)水平之和為258.76. 可以看出五味子乙
素1, 2水平之和差值z(mì)ui大, 說明五味子乙素對(duì)實(shí)
驗(yàn)結(jié)果影響zui大, 且高濃度好; 其次為蘆薈大黃
素, 低濃度好; 影響zui小的為黃芪多糖, 低濃度
好. 所以通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 我們以高五味子乙
素(100 mg/L)、低蘆薈大黃素(50 mg/L)、低黃
芪多糖(50 mg/L)的組方為*配比-復(fù)方五味子
素B(表1).
2.2 復(fù)方五味子素B及其成分體外抗胃癌細(xì)胞增
殖作用研究結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比, 五味子乙
素低、高濃度組, 蘆薈大黃素低、高濃度組和
復(fù)方五味素B組在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度A 值均
顯著性降低, 而黃芪多糖低、高濃度組的吸光
度降低不明顯; 增殖抑制率結(jié)果顯示, 五味子乙
素低、高濃度組, 蘆薈大黃素高濃度組和復(fù)方
五味素B組抑制率明顯增高, 其中復(fù)方五味子素
B的抑制作用zui為明顯(表2).
3 討論
五味子乙素(Schisandrin B)是五味子中重要的
木脂素類有效成分. 研究表明, 體外五味子乙
素能明顯抑制小鼠腹水型肝癌、小鼠S180-V癌
細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞的DNA合成[5], 能抑
制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋
亡[6], 可以增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721
細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的作用[7]. 本
研究結(jié)果也顯示, 50和100 mg/L五味子乙素對(duì)
胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖均有明顯的抑制
作用. 大黃的有效成分蘆薈大黃素(aloeemodin)
具有抗菌消炎功效, 體外可抑制金黃色葡萄球
菌、鏈球菌、白喉?xiàng)U菌、枯草桿菌、大腸桿菌
等多種細(xì)菌, 對(duì)胃幽門螺桿菌也有抑制生長(zhǎng)作
用. 此外, 動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)證明蘆薈大黃素能延長(zhǎng)
P388白血病小鼠的存活期[8], 誘導(dǎo)早幼粒白血
病細(xì)胞株HL-60, 人肝癌細(xì)胞系BEL-7402, HCC,
Mah/avu, PLC/PRF/5和HepG2及Hep3B等多種
腫瘤細(xì)胞凋亡[9-10], 能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PKC同工
酶、抑制其增殖進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡的作用[11]. 我
們以往的實(shí)驗(yàn)顯示蘆薈大黃素在12-48 h內(nèi)能明
顯抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖[12]. 本研究
結(jié)果發(fā)現(xiàn), 100 mg/L蘆薈大黃素能明顯抑制胃
癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖. 黃芪多糖(astragalus
polysaccharides, APS)是黃芪的主要活性成分之
一. 黃芪具有多種免疫調(diào)節(jié)的作用[13]. 在腫瘤防
治方面具有重要的作用. 大量研究顯示, 黃芪
多糖不能直接殺死腫瘤細(xì)胞, 而是能刺激淋巴
細(xì)胞增殖, 提高巨噬細(xì)胞吞噬功能, 增強(qiáng)NK細(xì)
胞活力, 通過增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作
用[14]. 但也有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, im APS對(duì)小鼠
移植性腫瘤S180和肝癌(Heps)有明顯的抑制作
用[15]. 我們體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, APS對(duì)胃癌細(xì)胞
株SGC-7901的增殖沒有明顯影響.
為了能提高單味中藥成分的抑癌作用, 我
們將五味子乙素、蘆薈大黃素和黃芪多糖合理
組方, 并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法篩選出了3種
成分的抑制胃癌細(xì)胞增殖的*配比-復(fù)方五味
子素B. 同時(shí)我們還比較了復(fù)方五味子素B及其
組成成分對(duì)胃癌細(xì)胞抑制的作用, 結(jié)果表明復(fù)
方五味子素B的抑癌作用比單純使用五味子乙
素、蘆薈大黃素和黃芪多糖的抑癌作用明顯. 3
種成分抑癌作用之間相互關(guān)系以及復(fù)方五味子
素B抑癌作用機(jī)制將在后續(xù)研究中進(jìn)行.
實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展走出“瓶
頸”的*出路. 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不僅為重組
抗胃癌中藥復(fù)方提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù), 而且提
示將中藥有效成分合理組方可能是開發(fā)現(xiàn)代化
復(fù)方中藥的有效方法和途徑之一.
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