接下來(lái)為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對(duì)流相互作用介質(zhì)（CIM）層析整體柱的兩步質(zhì)粒 DNA（pDNA）純化平臺(tái)！
該方法除了具有以上全部?jī)?yōu)點(diǎn)，并且可以純化時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，使其成為 GMP 環(huán)境下的大規(guī)模 pDNA 純化的選擇。
該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)快速操作，高流量，同時(shí)提供動(dòng)態(tài)結(jié)合能力和分辨率。
首先要為整個(gè)過程中的核心——兩步層析步驟，準(zhǔn)備細(xì)菌培養(yǎng)液
1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：
這是快速高效純化質(zhì)粒 DNA 亞型的基礎(chǔ)。
操作建議：
先收集菌體；然后采用堿性裂解法制備原料；
再將細(xì)菌細(xì)胞（通常是細(xì)胞生物質(zhì)或細(xì)胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；
通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進(jìn)行裂解。
2. 裂解液濃縮：
氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質(zhì)
裂解后，懸浮液變粘稠，通過加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細(xì)胞碎片和 SDS 復(fù)合物。
在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。
TIPS:
1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質(zhì);
2. 較高濃度的雜質(zhì)需要 CaCl2 濃度高達(dá) 1M;
3. 考慮測(cè)試多種濃度并評(píng)估產(chǎn)品中雜質(zhì)的有效去除和未受影響的 pDNA 產(chǎn)量;
4. 加入速度應(yīng)該很慢，以防止局部溫度上升;
5. 孵育后，進(jìn)行一系列澄清步驟，從離心或粗過濾開始，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結(jié)束。
（低溫有利于沉淀，混合過程應(yīng)該溫和操作，以防止 DNA 降解。）
前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。
BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時(shí)效性，均堪稱教科書式的經(jīng)典。
步純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；
步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從超螺旋（SC）級(jí) pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節(jié)省操作步驟和時(shí)間。
AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。
在弱陰離子交換柱上捕獲質(zhì)粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質(zhì)，樣品結(jié)合需要低電導(dǎo)率，通過稀釋實(shí)現(xiàn)。
隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質(zhì)粒 DNA。
層析條件
Monolithic column: | CIMmultus™ DEAE(2 μm)*1 |
Mobile phase: | Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2 | |
Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2 | |
Working flow rates: | 0.5 – 5 column volume (CV) /min (具體取決于樣品特性，使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸) |
*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
層析方法
1. 用去離子水稀釋細(xì)菌裂解物至電導(dǎo)率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。
2. 將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進(jìn)行過濾。
3. 將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。
4. 將澄清的稀釋細(xì)菌裂解液進(jìn)行上樣。
5. 用 20 CV 的緩沖液 A1 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。
6. 用 20 CV 的緩沖液 A2 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。
7. 用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。
圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質(zhì)粒 DNA 洗脫曲線
在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從 超螺旋（SC）級(jí) pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
為了富集質(zhì)粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。
該步驟進(jìn)一步去除了雜質(zhì)。
層析條件
Monolithic column: | CIMmultus™ C4 HLD (2 μm)*2 |
Mobile phase: | Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2 | |
Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4 | |
Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2 | |
Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 | |
Working flow rates: | 0.5 – 5 CV/min (具體取決于樣品特性、使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸) |
*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
層析方法
1. 調(diào)節(jié)來(lái)自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。
2. 用 20CV 的緩沖液 B0 來(lái)平衡 C4 HLD 柱。
3. 將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。
4. 用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。
5. 用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。
6. 用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。
7. 加樣 3 次后，對(duì)柱子進(jìn)行清洗。
圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質(zhì)粒 DNA
· 從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋
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